昆明山海棠在中药复方制剂中的定性与定量分析

因宁片是南方医科大学南方医院医药专家共同拟定的治疗阴虚阳亢型甲亢伴肝损害的临床经验处方，是以中医药理论为依据，注重整体辩证施治。并借助现代科技技术从药理学、药剂学等多学科进行深入研究，筛选上百种中草药经科学配伍精制而成。因宁片主要由黄芪、昆明山海棠、莪术、五味子等9味中药材组方而成，作为医院制剂在临床已使用多年，具有益气养阴、化痰祛瘀、散结消瘿之功效，对阴虚阳亢型甲亢伴肝损害有较好的临床疗效。然而昆明山海棠药材的定性与定量研究尚不系统与深入，目前昆明山海棠药材标准只有地方中药材定性（显微鉴别）标准并收录于广东省中药材标准2004版，无定量分析质量标准；无国家药材标准。昆明山海棠药材在制剂中的定性与定量研究，只有其单味药制剂片剂的定性（TLC）法与定量（干湿重法）标准，收录于《中国药典》2020版第一部中。迄今尚无昆明山海棠药材在中药复方制剂中的定性与定量研究报道。因此，为加强因宁片中君药昆明山海棠质量控制确保其制剂质量，进一步完善昆明山海棠药材在中药复方制剂中的质量标准研究。本研究采用TLC法与HPLC法对中药复方制剂因宁片中的昆明山海棠药材进行了定性与定量研究。

1 材料和方法

1.1 仪器与设备

5810R高速冷冻离心机（Eppendorf）；F-060ST福洋牌超声清洗机（深圳福洋科技集团有限公司）；SHZ-D（III）循环水式多用真空泵（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器有限公司；LINOMAT5薄层扫描仪（瑞士卡玛公司）；BCD-183CM美的冰箱（合肥美的荣事达电冰箱有限公司）；DGG-9076A电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；Agilentll00液相色谱仪(Agilent)。

1.2 材料与试剂

因宁片（批号20130315、20130408、20130415）共3个批次，为南方医科大学南方医院药学部提供；因宁片阴性片（批号20130315），为南方医科大学南方医院药学部提供；昆明山海棠对照品（批号121203-201503，中国食品药品检定研究院）；硅胶G薄层层析板（青岛海洋化工厂分厂）；默克（MERCK）薄层层析硅胶板（山东西美技术有限公司）；雷公藤甲素对照品（中国药品生物制品检定所，批号为111567）；中性氧化铝、乙酸乙酯及甲醇均为分析纯（广东光华科技股份有限公司）；乙腈为色谱纯，水为经2次蒸馏的去离子水。

1.3 因宁片中昆明山海棠的薄层定性分析

1.3.1 定性鉴别方法优化

患有稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛的患者，对QFR风险的容忍度较低，故可以选择QFR检查或FFR检查来获得功能学评估。虽然QFR评估存在上述风险，但由于患者病情稳定，所以评估结果导致即刻血运重建或延迟血运重建所带来的风险较低。有临床试验研究结果表明，QFR分析一致性并非劣效于FFR，患者将受益于QFR的无创分析，避免了由微循环扩张药物带来的不适，减少了诊断时间和费用，综合考虑患者受益大于风险。

1.3.1.1 供试品溶液制备 取因宁片适量，去包衣，研磨至粉末状，称取因宁片粉末3 g，加入乙酸乙酯100 mL超声1 h，另称取中性氧化铝15 g按干法装柱，将超声后乙酸乙酯溶液离心，上柱，收集流出液，蒸干，加甲醇1 mL制备成供试品溶液。

1.3.1.2 阴性对照品溶液制备 因宁片阴性对照品粉末3 g，加入乙酸乙酯100 mL超声1 h，另称取中性氧化铝15 g按干法装柱，将超声后乙酸乙酯溶液离心，上柱，收集流出液，蒸干，加甲醇1 mL制备成阴性对照品溶液。

“文明素养”示范。采用推荐和寻访相结合的方法，在全市范围大力实施“万千百”工程。展示“万家文明风”。在全市各主要媒体开辟专栏，发掘、推出家庭文明新事，用凡人小事打动人，用身边事引领身边人，将发动的过程变为再教育的过程，以此带动全社会风气的不断好转。选树“千人公德榜”。在新闻媒体、大型户外媒体等设立“千人公德榜”，及时宣传弘扬社会公德的典型，汇聚点滴“善小”，形成强大的道德正能量。上好“百堂道德课”。利用“万家文明风”展示和“千人公德榜”设立的契机，广泛收集身边典型人物的典型事迹，使之成为全市道德教育的生动教材。

1.3.1.3 药材阳性对照品溶液制备 昆明山海棠药材标准品3 g，加入乙酸乙酯100 mL超声1 h，另称取中性氧化铝15 g按干法装柱，将超声后乙酸乙酯溶液离心，上柱，收集流出液，蒸干，加甲醇1 mL制备成对照药材溶液。

1.3.1.4 薄层色谱条件 照《中国药典》（2020 版）薄层色谱法（通则0502），吸取阴性对照品溶液（无昆明山海棠药材）10 μL、因宁片供试品溶液（3个不同批次）20 μL和对照品溶液（昆明山海棠对照品）1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷：乙酸乙酯（5∶1）为展开剂，展开后取出晾干，紫外光365 nm下检视。

1.4.4 含量测定方法验证

在公路路基加宽工程施工期间，企业未能编制完善的质量管理与控制方案，缺乏综合性与系统化的管理机制与模式，未能统一施工质量与强度标准，缺乏可行性的施工依据。且在施工过程中，企业未能开展构造物的管理工作，很容易引发新旧路基之间的稳定性问题，难以提升整体结构拉应力与承载力，严重影响公路路基结构的综合荷载效果。

1.3.2.1 不同薄层板考察 选择不同厂家薄层板（青岛海洋化工有限公司、德国默克公司），按照1.3.1.4的方法点样展开，显色。

二是建立完善企业党建工作指导机制。继续发挥各级党员领导干部的作用，建立党员领导干部企业党建工作联系点，定期或不定期深入企业调查研究，指导开展党建工作。另外，完善企业党建指导员制度，专职靠上指导企业组建党组织和开展党建工作。例如，山东省广饶县建立了县级领导干部联系非公有制企业抓党建制度，34名县级党员领导干部每人联系一家非公有制企业和一个乡镇（街道），指导开展企业党建工作；同时，在没有党员或党员不足3名的非公有制企业，派驻党建指导员，帮助建立“兼合式”党组织，在企业开展党组织活动。

1.3.2.2 不同温度考察 采用同一厂家的薄层板（青岛海洋化工厂分厂），考察不同温度（4 ℃和40℃）条件对薄层鉴别方法的影响。

1.4.4.7 含量限度的确定 分别取3批因宁片，将其研磨成细粉，精密称取约6.4 g，按1.4.1项下制备供试品溶液；另精密称取雷公藤甲素对照品约10 mg，加甲醇溶解并制成每1 mL中约含雷公藤甲素5 μg的溶液，作为对照溶液。分别吸取供试品溶液及对照溶液各20 μL注入HPLC仪，记录色谱图，量取主峰面积，按外标法计算含量。

1.3.2.4 展开剂考查 在参考相关文献后选择以正己烷：乙酸乙酯：冰醋酸（10∶1.5∶1）进行展开剂考察。

1.4.4.3 线性 精密称取雷公藤甲素对照品10 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，从中精密量取适量，加甲醇稀释成一系列浓度的溶液，摇匀，精密吸取20 μL，注入HPLC仪，记录色谱图，量取主峰面积。

1.4 因宁片中雷公藤甲素定量分析

1.4.1 供试品溶液制备 取因宁片50片，研磨成细粉，称取约6.4 g，加乙酸乙酯50 mL，超声处理60 min，放冷，滤过，滤液通过用乙酸乙酯湿法装柱的中性氧化铝（8 g，200目，内径1～1.5 cm），用乙酸乙酯100 mL洗脱，收集流出液和洗脱液，减压回收溶剂，残渣加甲醇l mL使溶解，即得。

1.4.2 阴性对照溶液制备 取除昆明山海棠以外的其他药材，按因宁片提取工艺制备阴性提取物，按供试品溶液制备方法处理，按1.4.1项下从“加乙酸乙酯50 mL，超声处理60 min……”开始，至使溶解即得。

1.4.4.6 加样回收率试验 精密称取因宁片细粉适量，按1.4.1项下制备供试品溶液，另精密称取雷公藤甲素对照品适量，加甲醇溶解并稀释成每l mL中含5 μg的对照溶液，分别精密吸取20 μL注入HPLC仪，记录色谱图，量取主峰面积，以外标计算本品中雷公藤甲素的含量。精密称取已测出雷公藤甲素的本品粉末共9份，分高中低3个剂量，每个剂量各称3份，分别准确加入雷公藤甲素对照溶液（5 μg/mL）1.0 mL，按1.4.1项下规定制备供试品溶液，分别吸取20 μL，注入HPLC仪，记录色谱图，量取主峰面积。

1.3.2 耐用性考察

1.4.4.1 专属性试验 分别吸取上述溶液各20 μL，以上述条件考察，记录色谱图。

1.4.4.2 系统适用性试验 吸取上述供试品溶液20 μL，注入HPLC仪，记录色谱图，量取雷公藤甲素色谱峰及相邻峰的半峰宽、峰宽和保留时间，计算出理论塔板数，相邻峰保留时间与雷公藤甲素峰分离度。

四是以宣传培训为抓手营造良好社会氛围。组织部门应把人大制度理论纳入领导干部特别是镇街党（工）委书记教育培训的重要内容，通过邀请人大专家授课、开展民主法治教育等形式，提高镇街党（工）委书记对人大工作重要性的认识，提高强化其把党委决策与人大依法行使职权相结合的意识；宣传部门和新闻单位应把宣传人大工作列入年度工作计划，开展常态化、有针对性的宣传，及时报道人大工作中涌现出的好典型、好经验，提高全社会对人大工作的认知度。人大常委会应重点抓好镇街人大干部和代表的学习培训，通过举办学习班、交流研讨会等，使其深刻理解人大工作的性质和特点，熟悉掌握履职的程序和方法。

1.4.4.4 精密度试验 取因宁片适量，经研磨成细粉，精密称取适量（共6份），分别按1.4.1项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液；另精密称取雷公藤甲素对照品约10 mg，加甲醇溶解并稀释制成每l mL中含雷公藤甲素5 μg的溶液，作为对照溶液。分别精密吸取20 μL，注入HPLC仪，记录色谱图，量取主峰面积，以外标法计算含量。

1.4.4.5 稳定性试验 按1.4.1项下制备供试品溶液，于室温条件下放置24 h，分别于0，2，4，8，12，24 h吸取20 μL，注入HPLC仪，记录色谱图。

要根据入学季、毕业季不同时间段的不同特点和读者对文献信息的不同需求，提供不同的信息服务。如果以往做过类似的分类服务，就需要对以往的数据进行统计分析，根据受众面、满意度等适时进行调整相关服务，争取各类服务做得更好。若以往没有做过，就要从现在开始注意留意这方面的数据、资料、方案，为以后更好的开展类似服务奠定基础。

1.4.3 色谱条件的选择 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙睛-水（30∶70）为流动相；检测波长：218 nm；流速l mL/min；理论塔板数按雷公藤甲素峰计算不低于5000。

1.3.2.3 不同湿度考察 采用同一厂家的薄层板（青岛海洋化工厂有限公司），考察不同湿度（10%，90%）条件对薄层鉴别的影响。

2 结果

2.1 薄层色谱鉴别

除阴性对照品外，因宁片各组与阳性对照组，均在相应色谱处显色（R=0.6），斑点清晰可见。

LIETDOS-BIO是一款用来评价立陶宛核电站所产生的污染问题的软件。该模型使用两种浓集因子数据库：因场地而异的数据库以及通用数据库(主要基于欧盟FASSET中的数据以及源自俄语文献的数据)。该软件采用蒙特卡洛辐射转移模型，一种经特殊衍变而来的描述有机体模型的方法使得用户能够针对任何大小和形状的有机体计算剂量转换因子。该模型中参数的不确定性用统计学方法来进行处理。

2.2 耐用性考察

2.2.1 不同薄层板考察 青岛海洋薄层板与MERCK薄层板展开比移值分别为R=0.6、R=0.46，两种硅胶G板均可以达到较好的分离效果，斑点清晰。

2.2.2 不同温度考察 在温度4 ℃和40 ℃条件下展开比移值分别为R=0.62、R=0.68，阴性对照品溶液、供试品溶液及阳性对照药材溶液薄层色谱图斑点无明显拖尾现象，分离度较好。

在城市轨道交通领域大多基于事故致因理论建立安全评价模型，且通常在人员、设备、管理和环境中选择要素。例如，针对城市轨道交通运营安全风险评价，有些采用人员单要素建立评价模型[12]，有些采用人员和环境二要素建立评价模型[13]，更多的是采用人员、设备、管理和环境四要素进行建模[14-15]。

2.2.3 不同湿度考察 相对湿度10%及90%条件下展开比移值分别为R=0.6、R=0.51，阴性对照品、供试品溶液及阳性对照药材溶液的TLC斑点均能实现分离，分离度较好。

2.2.4 展开剂考查 色谱斑点产生偏移；供试品及阳性对照药材相应色谱斑点无法出现在同一水平线。

2.3 含量测定方法验证

2.3.1 专属性试验 雷公藤甲素的保留时间在14 min处，此位置供试品溶液色谱存在一明显的色谱峰，而阴性对照溶液在此处无任何色谱峰，对供试品溶液测定无任何干扰。

2.3.2 系统适用性试验 理论塔板数N为11320，相邻峰保留时间为14.13 min，与雷公藤甲素峰分离度R为1.26，达到了基线分离，该色谱条件能够满足分析要求。

1.提升核心素养是提升我国教育国际竞争力的迫切需要。随着世界多极化、经济全球化、文化多样化、社会信息化深入发展，各国都在思考21世纪的学生应具备哪些核心素养才能成功适应未来社会这一前瞻性战略问题，核心素养研究浪潮席卷全球。面对日趋激烈的国际竞争，我国要深入实施人才强国战略，提升教育国际竞争力，也必须解决这一关键问题。

2.3.3 线性 雷公藤甲素浓度在1.01、2.02、5.05、10.1、20.2、50.5、101(μg/mL)时，对应峰面积为17.7、33.6、85.3、204.4、406.2、1112.6、2224.9。浓度以峰面积对雷公藤甲素浓度进行线性拟合，得回归方程A=22.219C-19.165，=0.9999。结果表明：浓度在1～100 μg/mL范围内，线性关系良好。

2.3.4 精密度试验 对同一批供试品进行测定结果存在一定差异，RSD%为3%左右，试验的时间对结果影响不大。

通过对路段实测交通量调查数据的处理，依据式 （2）得出道路双向日交通当量轴载轴次约为230785.6次；结合式（1）（4）（5）可得该路段最大交通荷载为267kN。根据式 （9）可得东段顶管总顶力1852kN，经对比实测东段顶管总顶力1673kN，与实际值相对误差10.7%；理论计算得西段顶管总顶力1877kN，实测西段顶管总顶力1658kN，与实际值相对误差13.2%。经计算，西段顶管工程总顶力，与实际值对比并求得相对误差，如表5。

2.3.5 稳定性试验 从录色谱图得到对应主峰面积是90.4，94.1，88.2，93.3，85.0，90.9；峰面积平均值90.3，RSD为3.4%。供试品溶液于室温条件下放置24 h。结果表明：峰面积有一定变化，RSD为3.4%，溶液稳定性不好。

2.3.6 加样回收率试验 计算结果如下表2。

2.3.7 含量限度的确定 3批样品雷公藤甲素含量分别为0.34 μg/片、0.34 μg/片、0.28 μg/片，范围在0.28～0.34 μg/片内。因此，初步制订雷公藤甲素的含量标准为：因宁片中每片含雷公藤甲素不得高于0.6 μg。

3 讨论

昆明山海棠原药材标准，目前只有地方省级标准并收录于广东省中药材标准2004版，药材的定性鉴别为显微鉴别且无定量研究。昆明山海棠药材制剂质量标准，《中国药典》2020版收载其TLC定性鉴别与定量分析（干湿重分析）。然而昆明山海棠药材在中药复方制剂中的定性与定量研究迄今尚无文献报道。本文采用TLC法和HPLC法进行了昆明山海棠药材在中药复方制剂中的定性与定量研究，研究结果表明：该方法技术稳定，方法简便，较好地反映了昆明山海棠药材在中药复方制剂中的定性与定量情况，起到了控制其在中药复方制剂中质量的作用，同时也填补了昆明山海棠药材在中药复方制剂中定性与定量研究之空白。

因宁片为南方医院院内制剂，因其制剂质量标准中昆明山海棠鉴别方法稳定性不高。我们借鉴《中国药典》2010版昆明山海棠片定性鉴别方法对其进行鉴别时发现阴性对照品有干扰，无法达到定性鉴别目的。通过查阅文献［24-27］较正后，在原方法基础上，我们改变优化了提取溶剂，使用乙酸乙酯进行提取，提取液经氧化铝柱吸附，收集流出液，蒸干，再加甲醇溶解成样品溶液进行鉴别，达到预期目标。

在选择正己烷∶乙酸乙酯∶冰醋酸（10∶1.5∶1）作为展开剂时发现：各个色谱斑点无法整齐出现在一条水平线上，考虑到样品溶液以乙酸乙酯作为提取溶剂进行提取，极性相对于冰醋酸较小，且冰醋酸挥发性非常强，因此，在优化展开剂时将冰醋酸去除。同时发现以正己烷和乙酸乙酯作为展开剂时色谱斑点的高度会随乙酸乙酯的比例大小变化而变化，而在以正己烷：乙酸乙酯（5∶1）进行展开时色谱斑点居中，且色谱斑点清晰、分离度较好，因此，选择该比例作为最佳配比进行展开。系统耐用性试验表明：该方法对温度、湿度、不同厂家薄层板的耐用性均良好，达到研究预期目标。

在药品质量控制标准中定量分析亦是重要组成部分，本次定量研究采用HPLC法，本方法较本品从前的干湿重法定量，其技术更先进、准确性更高，更符合现行药品质量控制要求。我们选择对照品色谱峰扫描，选择检测波长为218 nm；选择流动相时，选择乙睛-水（30∶70）为流动相，色谱14 min处出现样品峰且阴性对照品无干扰，色谱峰基线平稳，峰形对称，同时供试品中雷公藤甲素色谱峰分离度良好，说明该方法具有良好的专属性；雷公藤甲素浓度在1～100 μg/mL范围内时得到回归方程A=22.219C-19.165，=0.9999，表明线性关系良好；最终测得3批样品中雷公藤甲素含量分别为0.34 μg/片、0.34 μg/片、0.28 μg/片，确定每片因宁片中雷公藤甲素限量不得高于0.6 μg。

(2)八达岭野生动物园安装监控摄像头共106个，东北虎园东北门、西北门各有1个监控摄像头，运行状况良好。由此可见，假若动物园工作人员随时查看监控录像，应该可以及时发现危险的发生并且采取措施。

综上所述，经优化的TLC法专属性强、操作简便，是中药复方制剂中昆明山海棠定性鉴别的可借鉴的方法之一；采用HPLC法对中药复方制剂中昆明山海棠药材进行定量分析。有专属性强、线性关系良好，操作简便等优点，且更符合现行药品质量控制之要求。本研究结果可为含有该药材的中药复方制剂产品定性与定量研究提供参考与借鉴。