固定化技术在燃料乙醇发酵生产中的应用与研究进展

蔡鑫磊,黄益平,胡 猛,夏 苗,樊现超,孙玮晨

(中建安装集团有限公司,江苏 南京 210000)

我国是工业和人口大国,近3年来年均石油消耗量超6亿吨,其中70%以上的原油依赖于进口,能源安全问题亟需重视。生物燃料乙醇作为交通运输燃料已在全球范围内得到广泛应用,将燃料乙醇和汽油调和制成的E10乙醇汽油不仅能在不改动汽车发动机的前提下直接使用,还因调和后的燃料汽油中氧的增加,使燃烧更为充分,防止爆燃爆缸现象发生,并且可以有效减少有害气的释放,将污染物控制在环保等级要求之内,显著降低环境污染[1-2]。

目前,我国燃料乙醇工业化仍以玉米、甘蔗、木薯和小麦等作物为主要原料,提取这类作物中的淀粉和糖,采用发酵技术制备得到工业级乙醇[3-5]。然而该方式发酵周期较长,且菌体耐受性受环境因素影响较大,使得工业乙醇产率低,这些技术问题制约着工业燃料乙醇行业的快速发展。为有效解决以上问题,燃料乙醇研究人员开始密切关注细胞固定化技术[6-7]。该技术源于酶固定化技术,将游离的细胞通过物理或化学的方法限制在固定空间内以达到细胞聚集的目的[8-10]。传统的工业燃料乙醇发酵制备,往往采用游离的酵母细胞间歇发酵的方式对淀粉等物质发酵[11]。考虑到酵母细胞处于游离状态,体系内细胞密度相对较低,发酵效果较差,且酵母回收时需进行高速离心,容易对酵母细胞产生损伤,难以回收利用[12]。与传统游离发酵相比,固定化发酵过程中酵母细胞被固定在一定空间范围内,可极大地减少酵母细胞的流失,且单位体积内酵母细胞多,对外界影响的抵抗力强,发酵效果更佳[13-14]。此外,在产品分离过程中,固定化酵母更容易与发酵醪液分离,可大幅提高固定化酵母的重复利用率。

1 固定化技术分类

对燃料乙醇发酵的细胞固定化方法主要有5种,分别是吸附法、包埋法、膜隔离法、交联法和絮凝法。

1.1 吸 附 法

吸附法的原理是将载体和酵母细胞通过静电吸附或离子键作用力进行结合,使酵母细胞固定在载体表面或内部,形成一层或多层酵母细胞膜。吸附法要求载体对酵母细胞吸附能力较强且无毒害作用。固定化载体所能吸附细胞的总数目主要与温度、pH、细胞以及载体特性等因素相关[15]。吸附法常用的载体有磷酸钙胶、DEAE-纤维素、硅胶、硅藻土、陶瓷和块状甘蔗等[16-17]。

梁磊等[18]采用块状甘蔗作为载体固定酵母细胞来实现工业乙醇发酵,以达到利用甘蔗汁发酵生产工业乙醇的目的。实验结果表明:将甘蔗块解冻、去木质素处理后,酵母效能大幅度提高。当甘蔗块的填装率为40%,固定发酵36 h时,所产乙醇质量浓度可达99.34 g/L,计算可得其发酵效率高达93.09%。

1.2 包 埋 法

包埋法是通过将酵母细胞固定在多孔物质空间中以实现对酵母菌固定的方法,其最大优点是操作方便,固定化后的细胞强度高。

酵母细胞一般被包裹在固定化载体内部,通过载体的多孔结构获取营养物质并不断增殖[19]。包埋法可以将酵母细胞较为严密地固定在介质内部,且该技术较为成熟,固定化酵母可循环重复利用,在生产中得到了广泛的应用。包埋法常用的固定材料通常分为两类:一类是海绵、聚氨酯泡沫塑料、沸石以及多孔陶瓷等硬性材料,另一类是海藻酸钠、琼脂、卡拉胶、聚丙烯酰胺等凝胶材料[20]。

王珂[21]采用海藻酸钠包埋酵母作为固定化粒子,在含[BMIN]Cl离子液体的培养基中进行乙醇发酵。研究结果表明:固定化发酵所产生的乙醇质量浓度高于游离发酵,且固定化酵母能重复使用至50次。

Chandel等[22]使用1 cm×1 cm野生甘蔗茎块“原位”包埋VS3酿酒酵母进行固定化,分批测试了野生甘蔗的酶水解产物的发酵。VS3游离细胞和固定化细胞分批发酵的乙醇产量分别为(19.45±0.55) g/L和(21.66±0.62) g/L。在分批重复发酵期间,固定化VS3细胞在第8个周期中表现出最大的乙醇产量(22.85±0.44) g/L,随后在后续发酵周期中逐渐减少。

1.3 膜隔离法

膜隔离法的原理是使用无菌半透膜将需要的细胞限制在固定空间内,该半透膜可选择性地允许基质和产物通过,酵母细胞则不允许通过[23]。膜隔离法的最大优点是操作方便,通过选择孔径大小来提高物质通过的选择性,能有效控制底物和产物的扩散[12]。缺点是半透膜容易发生堵塞,传质容易受限,生产成本较高,因此该方法在燃料乙醇生产中应用较少。

1.4 交 联 法

交联法的原理是通过双官能团或多官能团的交联剂与酵母细胞的表面基团反应,使细胞相互连接形成网状结构以达到将酵母细胞固定化的目的。交联法不需要载体,可以得到较高的细胞浓度。由于交联法是通过化学反应形成的化学键相连接,固定化酵母细胞间结合力高,环境耐受程度较高,可承受温度、pH的剧烈变化[23]。然而,由于交联反应过于剧烈,使得酵母细胞活性降低,无法再生,而且固化细胞机械强度较低。因此该方法在实际生产中应用较少,常与其他固定化方法结合使用[24]。

祝英等[25]使用玉米糖化醪作为发酵底物,使用交联法、琼脂凝胶法、海藻酸钙凝胶法和聚乙烯醇包埋法4种发酵培养手段对酵母进行合理固定。实验结果表明:将4种固定化酵母用于分批和连续发酵生产工业乙醇中时,交联法的发酵效率要明显低于其他3种方法,并且其稳定性也相对较差。

1.5 絮 凝 法

絮凝法的原理是利用微生物间相互吸附的能力使细胞吸附形成絮凝颗粒,以此将酵母细胞固定化。该方法同样不需要添加固定化载体,且其具有对酵母细胞的固定相对简单、细胞代谢能力强、传质阻力小以及细胞寿命长等优点。另外,絮凝法操作简单,固定化过程中不需要添加其他化学物质,因此酵母细胞在整个生长过程中未受到外来物质影响,有利于酵母细胞代谢目标产物,且不影响酵母细胞寿命。絮凝颗粒内部松散、传质阻力很小,因此絮凝颗粒存在刚性较差、易变性等问题[26-27]。

Verstrepen等[28]认为细胞絮凝的原因存在两种可能:一种是由相邻细胞表面存在的凝集素与甘露糖结合导致;另一种可能是由于细胞表面的多肽吸引作用或者疏水作用导致絮凝。伍彦华等[29]研究了自絮凝菌株的选育,以木薯为原料,比较了3株酵母SLS、SYA、SJY和一株自絮凝酵母FJY浓醪发酵生产燃料乙醇的性能,结果表明:4株酵母菌株中自絮凝菌株FYJ乙醇产量高,耗糖能力强,发酵86 h后,乙醇体积分数达到15.7%,总残糖1.35%,副产物产量比其他3株酵母菌株低20%。

2 固定化生物反应器

目前,传统的工业燃料乙醇发酵生产工艺开始向连续化发酵技术转变,主要目的是在原有工艺基础上将酵母固定化技术和连续发酵相结合,从而提高工业乙醇产出率,其中最为关键的环节就是生物反应器的选择和工艺参数的设定。

2.1 流化床反应器

流化床反应器的主要原理是通过流体流动让反应体系中的固定层颗粒处于悬浮运动状态。根据反应器应用环境可将其分为两类:固相加工和液相流体加工[30]。该反应器的最大优点是传质及传热效率高,便于连续操作。但该类反应器对固液相要求相对苛刻,只能应用在固定化载体与发酵液密度接近的两相反应中,其主要原因是发酵液密度过大会导致固定化细胞在整个反应体系中上浮效果不理想,反应不充分,出现乙醇产出率低的现象[21]。

赵玲等[31]以木薯淀粉糖化醪为发酵原料,采用海藻酸钙包埋的固定化酵母细胞和流化床反应器进行乙醇发酵。在反应器离子填充率为30%,发酵底物初糖质量分数为15%～17%,发酵时间为9 h条件下进行反应。发酵结束后成熟醪中乙醇体积分数为9.5%左右,残余还原糖质量分数不高于11%,乙醇生产能力稳定在5.17～5.9 g/(L·h)。在发酵底物初糖质量分数为24.53%,发酵时间11 h条件下,成熟醪中乙醇体积分数为12.1%,残余还原糖质量分数为0.91%,乙醇生产能力控制在6.08 g/(L·h)。

2.2 填充床反应器

填充床生物反应器主要是将固定化介质填充进反应器内部制成稳定床层并通入底物溶液进行反应。该反应器的主要优点在于返混小、结构简单和机械磨损率低等[21,23],适用于各种不同形状的固定化载体和没有固体颗粒、黏度不高的底物溶液。该反应器的不足在于在操作过程中无法对固定化介质进行更换,因此会出现风沟、气沟等现象,且存在传质及传热效果较差等问题。

Liu等[32]以过期大米为发酵原料,采用棉纤维吸附固定化酵母,使用具有多层填充床固定结构和多分支循环路径的320 t中试反应器代替典型的圆柱形固定反应器进行乙醇发酵。固定化酵母完成发酵后的乙醇体积分数和发酵效率均值分别为12.46%和83.72%,分别比游离细胞发酵高0.45%和3.2%。该发酵重复32批次,结果表明该发酵方式具有良好的重复性和长期稳定性。

2.3 气升式反应器

气升式反应器是由鼓泡式反应器演化改进而来,气源是该反应器的主要动力装置。其原理是依靠纯液体和含气泡液体之间的密度差来完成特定路径的流动,气体通过流动循环来完成物质间的反应[33]。该反应器有两个主要的液体池,通入气体部分为升气管,不通入气体部分为降液管[34]。其主要优点是节能环保,且反应器自身可明显降低内部剪切应力,对固定化细胞基本不会产生任何破坏。

张庆文等[35]以玉米粉为原料,使用一种15 L改进型气升式外环流反应器进行乙醇发酵,发酵48 h后,测得的乙醇体积分数高达12.8%,取样测得残糖质量浓度为3.8 g/L,与普通型气升环流反应器相比,发酵效率得到极大的提升。

2.4 搅拌釜反应器

搅拌釜反应器是较为传统的生物化学反应器,该类反应器通过机械搅拌对搅拌釜内部物质进行充分搅拌,以达到反应目的。虽然反应器存在搅拌装置,混合较为充分,反应比较彻底,但由于整个过程为机械搅拌,因此当反应过程中搅拌产生的剪切力过大时,会对体系内固化的细胞结构造成一定影响,导致固定化细胞外泄[21,33]。

季更生等[36]以30 g/L葡萄糖和15 g/L木糖为原料,将两者混合均匀后作为发酵底物加入到1.5 L的全混釜生物反应器中,对1株树干毕赤酵母驯化菌株进行连续发酵反应,得出二级连续发酵对还原糖的利用率比一级发酵高6%的结论。

2.5 膜式反应器

膜式反应器的原理是将乙醇发酵与膜的渗透汽化进行耦合,此类反应器由于膜的比表面积相对较大,因此在整个工艺过程中催化效率也相对较高。但是膜反应器在发酵过程中会产生浓差极化、膜污染等问题,进而导致传质效率下降、膜孔堵塞,不利于生产,因此该类反应器中的膜需要定时清洗和维护[37]。

丁文武等[38]采用硅橡胶膜(PDMS)渗透汽化与酵母细胞固定床耦合发酵连续化生产乙醇,该系统能大幅度降低乙醇对细胞的抑制作用,提高乙醇产率。该系统经378.5 h连续稳定运行,下游产品产率最大为32%,总通量最大值为690 g/(m2·h),计算得其分离因子为7.2,分离效果较好。该系统PDMS膜投入使用后,发酵液内乙醇质量浓度由间歇发酵时的70 g/L降至43 g/L,大大减轻了乙醇对细胞的发酵作用。通过将PDMS膜与酵母固定床耦合,有效提高了生产效率,乙醇体积产率和葡萄糖发酵效率分别是游离连续发酵的2.1倍和2.5倍。

3 共固定化技术

共固定化技术的最大特点是能在同一载体内部同时嵌入2种或2种以上的酶或细胞,从而建立一个共固定化发酵体系。这种共固定化体系能将2种不同细胞的功能同时发挥出来,以达到提高乙醇产率的目的[39]。该类技术的最大优点是将混合发酵和固定化技术的优点相结合,兼具发酵和固定双重属性[40-41],可有效缩短生产周期、提高生产率。使用不同原料生产燃料乙醇时,不同原料水解后的糖化液中不仅含有葡萄糖,还可能含有半乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖、乳糖和木糖等多种糖分,使用单一的微生物很难将其完全代谢利用[42-43]。而利用共固定化技术使用多种细菌或真菌协同发酵能够有效提高底物的利用效率。共固定化技术所用方法与上述固定化方法基本相同,有吸附法、包埋法和交联法等。共固定化技术最大的优势是能够合理地将固定化优势与多种酶或细胞的功能相结合,从而提高其选择性[40]。与传统发酵技术相比,共固定化技术具有发酵时间短、乙醇产率高、可连续化生产等优点,可以帮助企业节能降耗,大幅度降低燃料乙醇生产成本。

周志明等[44]选用海藻酸铝凝胶作为反应体系的载体,选用木薯淀粉为反应原料,将酵母细胞和糖化酶共固定化发酵,通过同步糖化发酵的方式来制取工业乙醇。研究表明:在整个反应体系中影响转化的主要因素有凝胶填充率、糖化酶添加量和发酵温度等。通过正交实验优化反应工艺,优化后的工艺参数为凝胶填充率50%、糖化酶添加量300 U/g、发酵温度37 ℃、pH 4.0～4.5、料液质量比1∶2,当醪液中乙醇体积分数为13.4%时,其淀粉利用率达到峰值90.2%。

Altuntas[45]通过对运动发酵单胞菌和葡萄糖苷酶进行共固定化来发酵生产乙醇,结果表明:该反应体系中98%的底物已转化,乙醇产率高达7.6 g/(L·h)。Lee等[46]采用DEAE-玉米秸秆材料吸附酿酒酵母和树干毕赤酵母进行共固定化,发酵海带水解物生产乙醇,结果表明:水解物中葡萄糖和木糖完全转化为乙醇,乙醇的产率为0.126 g/(L·h),比单独使用树干毕赤酵母发酵海带水解物的乙醇产率高2.7倍。

4 结 论

细胞固定化技术的发展为传统乙醇发酵行业带来了全面的技术革新。众多研究成果表明:固定化酵母相较于游离酵母具有明显优势。虽然固定化酵母发酵乙醇具有发酵效率高、乙醇产率高和附加值高等优点,但固定化载体易结垢、发酵过程中的杂菌污染等问题也制约着固定化酵母在燃料乙醇发酵生产中的大规模应用。因此,今后可从构建具有良好发酵和吸附性能的酵母菌株、开发易于糖和乙醇通过的固定化载体、构建同步糖化发酵的共固定体系等方面进行深入研究。随着固定化技术在燃料乙醇领域的深入研究及应用,固定化技术将有效地推动燃料乙醇工业生产的快速发展。