不同香型白酒对斑马鱼醉酒行为的影响

陈欣怡，丁子元，刘永泉，余枚珠，夏 冰，郑晓卫，*

（1.中粮营养健康研究院有限公司，北京 102209；2.酒鬼酒股份有限公司，湖南 湘西土家族苗族自治州 416000）

白酒具有社交产品的本质属性，一直以来承载了人们的情感交流和文化传承[1]。中国是白酒的生产和消费大国，白酒对人体健康的作用说法不一[2]。饮酒不当会引发社会问题，也会导致过早死亡和多种疾病等危险[3]。随着社会老龄化和人们健康意识的不断提高，人们对于白酒的消费逐渐从感性走向了理性[4]。人们对饮酒满足美好的精神享受的同时，对于白酒的饮用舒适度有了更高的要求[5]。饮用舒适度作为饮酒后人体最直接的体验表现，反映了酒品质的好坏[6]。越来越多的白酒生产企业开始关注饮后感，尤其是酒类消费市场已经由饮酒到舒适饮酒进行深度转变[7]。

饮前及饮中的饮用舒适度的评价主观性较强，个体差异对两者影响较大。而对饮后舒适度的评价，因饮用者会产生一系列生理反应，评价指标相对客观[8]。造成饮后不适感的原因相当复杂，除了饮酒人的身体状况、饮用量、饮酒习惯、思维情绪及环境因素等以外，还有酒体本身设计和质量的因素，主要包括醛类、醇类物质等[9]。目前，虽然对于影响白酒饮用舒适度的确切作用机制尚不明确，但一般认为是多种因素共同作用产生的综合结果[10]。近年来，随着生命科学研究手段的不断发展，越来越多行业内学者通过建立动物模型评价体系，来直观评价饮后感[8]。张梦妍等[11]根据醉酒昏睡期小鼠的醉酒时间、醒酒时间建立了白酒饮用舒适度评价模型。格绒泽仁等[12]通过小鼠旷场实验结合高级醇类物质定量分析，建立了针对浓香型白酒饮后不适感的关键高级醇类物质关联性判定方法。越来越多的研究认为酒体特征组分的整体协调性对醉度产生较大影响，合适的杂醇、酸、酯比例可有效降低醉度[13]。目前较多研究利用小鼠进行白酒相关试验，但规模小，人工操作也较复杂，成本较高。斑马鱼1994年起被正式确定为一种新型的模式生物，被认为是一种适合神经化学和行为研究的脊椎动物，它体型小、繁殖速度快、成本低、易于操作且实验周期短[14]。目前，斑马鱼已经成为最受学者重视的脊椎动物模式生物之一，在很多学科上的应用也显示出了很大的潜力[15]。在酒的研究领域中，斑马鱼模型在葡萄酒研究中已被应用，钱星文等[16]建立斑马鱼兴奋期醉酒模型，评价药食同源健康产品益甘舒对斑马鱼的解酒作用。国外也有报道通过评估斑马鱼焦虑样行为、运动以及大脑中的氧化损伤，研究N-乙酰半胱氨酸对急性乙醇暴露斑马鱼的影响，以期评估防止酒精宿醉的药物[17]。但斑马鱼模型尚无在白酒方面的应用。

视频追踪已经成为研究斑马鱼行为的标准流程，通过视频记录其运动过程，并提取运动轨迹和运动特征，如速度、路程等，并对这些参数进行分析来进行生物学研究[18]。本研究针对10款市售的4种香型的白酒，通过建立斑马鱼醉酒模型，通过视频追踪分析比较斑马鱼暴露于不同白酒1 h和2.5 h后运动的行为参数比。同时结合白酒高级醇和醛类物质的定量分析，建立了引起饮后感差异判定的新方法，确定馥郁香型白酒饮后感快速评价体系。为进一步提高酒类品质，提高饮用舒适度提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酒样均选用知名品牌白酒，两款酱香型白酒A、B，三款浓香型白酒C、D、E，两款清香型白酒F、G，三款馥郁香型白酒H、I、J，食用酒精（酒精度均为52%vol）：市售；受精后5 d（5 dpf）的野生型AB品系斑马鱼（饲养于杭州环特生物科技股份有限公司养鱼中心（SYXK（浙）2012-0171），养鱼用水温度为28 ℃（水质：每1 L反渗透水中加入200 mg市售的速溶海盐，电导率为450～550 μS/cm；pH值为6.5～8.5；硬度为50～100 mg/L CaCO3），饲养管理符合国际AAALAC认证，认证编号为001458）：杭州环特生物科技股份有限公司。

仲丁醇、正丙醇、异丁醇、2-戊醇、正丁醇、活性戊醇、异戊醇、正戊醇、正己醇、2,3-丁二醇、丙二醇、糠醇、β-苯乙醇、乙醛、正丙醛、异丁醛、乙缩醛、异戊醛、糠醛、苯甲醛标准品（均为色谱纯）：上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

SZX7解剖显微镜：日本OLYMPUS公司；VertA1型CCD相机：上海土森视觉科技有限公司；V3.11行为分析仪：法国ViewPoint Life Sciences公司；6孔板、96孔板：无锡耐思生命科技股份有限公司；Agilent 7890B气相色谱仪（配氢火焰离子化检测器）（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）、CP-WAX57CB色谱柱（50m×0.25mm×0.20μm）：美国Agilent 公司；ME204分析天平（感量为0.1 mg）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 动物实验

随机选取5 dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。实验组分别水溶给予2%浓度的酒样A、B、C、D、E、F、G、H、I、J，对照组1为与酒样同浓度的优级食用酒精，同时设置对照组2为正常养殖水，每孔容量为3 mL。28 ℃分别处理1 h和2.5 h后，将酒样移除，随机选取10尾斑马鱼利用斑马鱼行为分析仪监测斑马鱼的20 min内运动速度、总运动距离和运动轨迹，并评价酒样对斑马鱼运动功能的影响。

1.3.2 酒体风味成分检测方法

准确吸取待测白酒样品5 mL，加0.1 mL内标溶液（2%），混匀，经0.45 μm的有机滤膜过滤后供气相色谱仪测定[19]。醇、醛类物质测定采用气相色谱法，其色谱条件如下：色谱柱温度：初温35 ℃，保持1 min，以3.0 ℃/min升至70 ℃，然后以3.5 ℃/min升至180 ℃，再以15 ℃/min升至210 ℃，保持5～15 min；检测器温度250 ℃；进样口温度250 ℃；载气为高纯氮气（N2）（纯度99.999 9%），流量1.0 mL/min；进样量1.0 μL；分流比20∶1。采用内标法，内标物选用2%叔戊醇、2%乙酸正戊酯、2%2-乙基丁酸。

1.3.3 行为参数比的测定

由行为参数计算行为参数比，可以减少实验动物自身原因造成的误差[20]。若行为参数比越接近于1，被认为酒对行为情绪的影响越小，该研究中行为参数比以平均速率比表示[21]。

平均速率比=暴露酒样后斑马鱼运动的行为参数/未暴露酒样斑马鱼运动的行为参数。

1.3.4 统计学分析方法

采用SPSS 24.0软件进行数据的统计分析，使用单因素ANOVA方法进行统计，结果采用“平均值±标准差”（）表示。利用主成分分析法（principal component analysis，PCA）降维的思想，将多个变量转化成为少数的几个综合的变量进行分析，并使用Origin 8.0作图。

2 结果与分析

2.1 斑马鱼行为学实验结果

2.1.1 运动行为学指标测定结果

本研究前期的研究成果表明，斑马鱼对2%的53%vol酒样的耐受性较好。斑马鱼分别暴露于酒样1.0 h和2.5 h后转移至正常养殖水观察1.0 h，发现在前20 min内，各酒样对其饮后行为的影响最大。因此，本实验对停止暴露酒样后20 min内的斑马鱼行为数据进行统计，结果见表1。

表1 各处理组斑马鱼运动行为学指标Table 1 Behaviors of zebrafish in different treatment group

由表1可知，斑马鱼暴露于酒样A、B 1.0 h与对照组2有显著性差异（P＜0.05），而暴露于酒样A组2.5 h与对照组2间无显著性差异（P＞0.05），暴露于酒样B 2.5 h与对照组2有极显著差异（P＜0.01）。斑马鱼暴露于酒样C、D、E 1.0 h和2.5 h均与对照组2有极显著性差异（P＜0.01）。无论斑马鱼暴露酒样1.0 h或2.5 h，酒样F组、食用酒精对照组1和正常养殖水对照组2间无显著性差异（P＞0.05），表明可以消除乙醇对引起饮后不适的关键物质的干扰，该结果与格绒泽仁等[12]的研究结果相似。而暴露于酒样酒样F组2.5 h与对照组间无显著性差异（P＞0.05）。斑马鱼暴露于酒样G 1.0 h和2.5 h均与对照组有显著性差异（P＜0.05）。其他酒样H、I、J彼此间无显著性差异（P＞0.05），但均与对照组有极显著性差异（P＜0.01）。以上结果发现同一种香型酒样具有相似的趋势，相同品牌下不同品类的酒样H、I、J差异不大，这可能与生产工艺有关。

2.1.2 斑马鱼行为参数比

由行为参数计算行为参数比，可以减少实验动物自身原因造成的误差[21]。若行为参数比越接近于1，被认为酒对行为情绪的影响越小，斑马鱼饮后行为恢复正常并与未饮酒斑马鱼感受相当，认为斑马鱼醒酒，该行为参数比与1的差值的绝对值为行为偏离度，行为偏离度越小，饮后感的舒适性越高[22]。斑马鱼暴露酒样不同时间后20 min内的平均速率比测定结果见图1。

由图1（a）可知，斑马鱼暴露于酒样A1.0 h后，平均速率比在前20 min内酒样A组与对照组1有极显著差异（P＜0.01），第20 min时酒样A组与对照组1无显著性差异（P＞0.05），酒样A组平均速率比接近1，处于醒酒状态。15 min时酒样B组与对照组1无显著性差异（P＞0.05），酒样B组斑马鱼醒酒时间超过20 min。斑马鱼暴露于酒样C、D 和E 1.0 h后，平均速率比显著低于对照组1（P＜0.01），醒酒时间超过20 min。其中酒样D组斑马鱼平均速率比显著低于其他各组（P＜0.01），表明受抑制情况显著高于其他各组（P＜0.05）。酒样F组和对照组1在10～20 min时无显著性差异（P＞0.05），酒样F组平均速率比在1左右，处于醒酒状态。酒样G组的平均速率比小于1，与对照组1有显著性差异（P＜0.05），醒酒时间超过20 min。酒样H、I、J组斑马鱼的平均速率比均小于1且显著低于对照组1（P＜0.01）。前5 min内与酒样A和B组无显著性差异（P＞0.05），10～20 min与酒样C和E组无显著性差异（P＞0.05），有下降再升高的趋势，醒酒时间超过20 min。说明暴露于馥郁香型白酒的斑马鱼在醒酒过程前期与暴露于酱香型白酒后的饮后感相当，在醒酒过程的后期与暴露于浓香型白酒后的饮后感相当。

图1 暴露酒样后20 min内斑马鱼的平均速率比Fig.1 The average rate ratio of zebrafish within 20 min after exposure of liquor

由图1（b）可知，斑马鱼暴露于酒样2.5 h后，前10 min内所有酒样组斑马鱼的平均速率比均低于1，之后有逐渐上升趋势。在10～20 min内，酒样A和G组斑马鱼平均速率比接近于1，与对照组1差异显著（P＜0.05）。酒样F组与对照组1斑马鱼的平均速率比上升至1以上且两者间无显著性差异（P＞0.05）。酒样A、F、G、H、J组与对照组1在20 min时斑马鱼平均速率比接近于1，而酒样B、C、D、E、I组斑马鱼平均速率比在0.6左右，醒酒时间相对更长。说明随着暴露酒样时间延长，馥郁香型白酒H、J与酱香型白酒A和清香型白酒F、G醒酒时间相当，酒样H、J醒酒较快。

2.2 十款白酒高级醇类、醛类物质成分的定量分析

高级醇含量不合理是影响酒体醉酒程度的常见原因之一，高级醇含量过高，会抑制神经递质的表达，饮酒者次日醒来会出现头晕、头痛症状[21-23]。此外，过量的醛类物质饮后也可造成头痛，降低饮用舒适度[9]。所以本研究主要以高级醇类、醛类物质为研究对象。通过GC-FID检测A、B、C、D、E、F、H、G、I、J十款白酒的高级醇类及醛类物质含量，结果见表2。

由表2可知，共检出13种高级醇类物质及7种醛类物质。酒样A、B中高级醇类和醛类物质总含量较高，酒样A中丙二醇、糠醇、β-苯乙醇、异丁醛、苯甲醛和糠醛含量相对较高。酒样B中正丙醇、乙醛、正丙醛、乙缩醛含量较高。酒样D中2-戊醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、2,3-丁二醇、异戊醛含量较高。酒样G中异丁醇、活性戊醇、异戊醇、β-苯乙醇含量较高。酒样J中仲丁醇含量较高。酒样E和F高级醇类和醛类物质含量均相对较低，酒样C、H、I、J高级醇类和醛类物质含量居中。

2.3 主成分分析结果

2.3.1 高级醇类物质主成分分析

对十款不同香型、品牌的白酒检测的高级醇类物质进行主成分分析，通过主要主成分方差百分比和累积方差贡献率分析可知，前3个主成分特征根大于0.1，且累计方差贡献率达到86.8%，因此选择前3个成分因子作为主成分因子。由因子负荷矩阵可知，异丁醇、活性戊醇、异戊醇在主成分1上有较大载荷，正丁醇、正己醇、正戊醇在主成分2上有较大载荷，糠醇在主成分3上有较大载荷。将上述PCA结果进行投影，投影图见图2。

图2 高级醇类物质主成分分析投影图Fig.2 Projection plot of principal component analysis for higher alcohols

由图2可知，各个酒样中3个主成分的权重各不相同，表明不同香型、品牌的酒样中不同主成分所代表的高级醇类物质的贡献度不同。酒样A、B和C中主成分3所占权重最大，表明主成分3所代表的糠醇在其所含的高级醇类物质中起主要作用，且在酒样A中的作用程度大于酒样B和C。酒样D、E、J中主成分2所占权重最大，表明主成分2所代表的正丁醇、正戊醇、正己醇在其所含的高级醇类物质中起主要作用，且在酒样E中的作用程度更显著。酒样F和G中主成分1所占权重最大，表明主成分1所代表的异丁醇、活性戊醇、异戊醇在其所含的高级醇类物质中起主要作用。酒样H和I中3个主成分均不起主要作用。

2.3.2 醛类物质主成分分析

以醛类物质作为指标进行分析，通过主要主成分方差百分比和累积方差贡献率发现前3个主成分特征根大于0.1，且累计方差贡献率达到92.5%，因此选择前三个成分因子作为主成分因子。由因子负荷矩阵可知，异戊醛、乙醛在主成分1上有较大载荷，苯甲醛、糠醛在主成分2上有较大载荷，苯甲醛在主成分3上有较大载荷。将上述PCA结果进行投影，投影图如图3。

图3 醛类物质主成分分析投影图Fig.3 Projection plot of principal component analysis for aldehydes

由图3可知，各个酒样中3个主成分的权重各不相同，表明不同香型、品牌的酒样中不同主成分所代表的醛类物质的贡献度不同。酒样A、B中主成分2所占权重最大，表明主成分2所代表的苯甲醛、糠醛在其所含的醛类物质中起主要作用。酒样C、D、G中主成分3所占权重最大，表明主成分3所代表的苯甲醛在其所含的醛类物质中起主要作用。酒样E、F、H、I、J 中主成分1所占权重最大，表明主成分1所代表的异戊醛和乙醛在其所含的醛类物质中起主要作用，且在酒样I中的作用程度更大。

从酒样中高级醇类及醛类物质作为指标进行主成分分析发现，酒样A、B和C中起主要作用的高级醇是糠醇。酒样D、E、J中起主要作用的高级醇是正丁醇、正戊醇、正己醇。酒样F和G中起主要作用的高级醇是异丁醇、活性戊醇、异戊醇。苯甲醛是酒样A、B、C、D和G中起主要作用的醛类物质，此外酒样A和B中起主要作用的醛类还包括糠醛。酒样E、F、H、I、J 中起主要作用的醛类是异戊醛和乙醛。

3 讨论

本研究结合斑马鱼行为学实验和酒样高级醇、醛类物质主成分分析，对能引起不同香型、品牌白酒饮后不适的关键物质进行初步判定。研究中通过利用斑马鱼行为学实验，根据饮后20 min内的平均行为偏离度发现，暴露于馥郁香型白酒的斑马鱼在醒酒过程前期与酱香型白酒饮后感相当，在醒酒过程的后期与浓香型白酒饮后感相当，其中浓香型白酒酒样D为引起斑马鱼饮后不适感最强的酒样。从酒样中高级醇类和醛类物质主成分分析结果来看，酒样D中起主要作用的高级醇是正丁醇、正戊醇、正己醇，且发现酒样D在所有酒样中这三种物质含量最高。结合行为学实验和高级醇物质含量检测结果，初步推测正丁醇、正戊醇、正己醇为引起酒样D饮后不适的关键高级醇，三种物质的高含量导致了饮后不适感较强。格绒泽仁等[12]进行了浓香型白酒不同品牌酒样中高级醇类物质主成分分析，发现其中以正丁醇、正戊醇、正己醇为关键高级醇的酒样饮后不适感弱于以异戊醇、异丁醇和2-戊醇为关键高级醇的酒样，认为异戊醇为引起浓香型白酒饮后不适的关键高级醇之一。该结果与本研究结果有所不同，推测原因可能是本实验涉及不同香型、不同品牌的白酒，酿造工艺不尽相同，样品特征差异范围较大。

此外，斑马鱼实验中对比了不同暴露时间下的酒样饮后感差异，发现酒样A在暴露时间从1.0 h延长至2.5 h后，行为偏离度反而减小，饮后舒适度增强。结合高级醇物质和醛类物质含量检测结果，发现酒样A中正丙醇、丙二醇、糠醇、β-苯乙醇、苯甲醛和糠醛等部分醇类和醛类物质含量相对较高，但是酒样A整体舒适度却较高，可能与酸、酯比例有效降低上述物质产生的负影响有关。由于白酒是一个复杂的体系，引起饮后不适的关键物质可能是综合作用的结果，研究涉及的酒样有限，关于白酒饮后舒适度未来还需更深入的探究。此外，尽管学术界的成熟的视频追踪算法在斑马鱼成鱼上取得了较好的效果，但由于幼鱼的尺寸小、个体特征不明显、交叉情况严重、运动不连续的特点，市场上商业的视频追踪软件对幼鱼的追踪效果并不完美，未来需要更深入的研究助力相关领域的探索[24-25]。

4 结论

本研究利用斑马鱼试验对比了不同香型、品牌的白酒饮后舒适度，从平均行为偏离度角度分析，发现同一香型的酒样饮后感相似，馥郁香型白酒的饮后舒适度前期与酱香型白酒相近，后期与浓香型白酒相近。随着暴露酒样时间延长，暴露于馥郁香型白酒的斑马鱼与暴露于酱香型和清香型白酒斑马鱼的醒酒时间更接近。初步认为这与馥郁香型白酒兼具浓、清、酱香三种特征有一定关系。此外，初步判定正丁醇、正戊醇和正己醇为引起不同香型白酒饮后不适的关键高级醇。本研究为进一步深入探究白酒饮后感及其质量控制体系奠定基础。