传统发酵霉豆渣中微生物的分离 及其作为豆渣发酵剂的应用

毛欣欣，雷茜，陈伟哲，Kashif Hussain，王洁，方祥，廖振林*

（1.华南农业大学食品学院，广东广州 510642）（2.广东茂名农林科技职业学院，广东茂名 525027）

豆渣是大豆在制作豆浆、豆腐等大豆加工产品的过程中产生的废渣，通常是白色或淡黄色[1,2]。豆渣与大豆的营养成分类似，在豆渣干物质中膳食纤维占40%～60%，蛋白质占15%～25%，脂质占10%，是一种典型的低热量高蛋白质的食品资源，在加工食品的应用上极具潜力[3-6]。豆渣的产量巨大，尤其是我国作为大豆及其制品的高消费国家，每年仅豆腐生产制造业，就要产生约280万t豆渣[7,8]。然而，新鲜豆渣具有水分含量高（70%～80%）、口感粗糙、豆腥味浓烈等特点，使其在食品工业的应用上受到巨大的束缚，除了少部分被加工成食品或饲料，绝大部分豆渣作为农业废弃物进行填埋或焚烧[9,10]。

霉豆渣是湖南、湖北、安徽、广西、江西等地区较为常见的传统发酵豆渣制品[11]。豆渣经清浆、压榨除水、蒸煮、摊开晾凉、压制成型、霉制等步骤制成霉豆渣，其中霉制是霉豆渣制作的关键步骤，经覆盖稻草自然霉制发酵后，豆渣表面被白色霉菌菌丝包裹，故此得名霉豆渣[11,12]。霉豆渣改善豆渣粗糙的口感，消除豆渣的腥味，形成一种富含多种氨基酸和多肽的豆渣发酵制品[13]。研究发现，豆渣在发酵过程中，粗纤维含量降低，改善豆渣粗糙口感；大豆蛋白水解产生肽和游离氨基酸，去除豆渣不良风味，提高豆渣的溶解性和抗氧化活性；豆渣中脂肪和多糖也进一步分解成脂肪酸和小分子糖类，提高豆渣的消化率，丰富豆渣的营养价值[14-17]。此外，微生物发酵可降低或消除豆渣中胰蛋白酶抑制剂、皂甙和植酸等抗营养物质，改善豆渣应用价值[18-20]。

目前，霉豆渣主要以家庭作坊式生产，一般采用自然发酵。自然发酵制作的霉豆渣具有发酵周期长、易受杂菌污染、成品质量受自然环境影响较大等缺点，导致霉豆渣的产品稳定性和安全性较低，无法实现高效、安全、工业化的生产[21,22]。近年来，为了提高豆渣的综合利用率，减少资源浪费，已经有学者从广西、湖北等地区的霉豆渣中分离出雅致放射毛霉、运动发酵单胞菌、粗糙脉孢菌等能够利用豆渣的微生物[14,23,24]。本研究对湖南邵阳霉豆渣中微生物进行分离纯化与鉴定，旨在从湖南邵阳地区的霉豆渣中分离能够利用豆渣中营养物质的菌株发酵豆渣，开拓豆渣发酵新途径，提高豆渣综合利率，减少豆渣的废弃。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

霉豆渣：由湖南省邵阳市某家庭小作坊提供，将样品放于无菌采样袋密封，并存储于-20 ℃备用。

豆渣：由博罗罗浮山润心食品有限公司提供，并存储于-20 ℃备用。

DPPH、ABTS、没食子酸为色谱纯；福林酚、氯化钠等试剂为分析纯。

1.2 主要仪器设备

LIOO S600T型显微镜，深圳市海量光电有限公司；Mastercycler nexus型PCR仪，德国Eppendorf公司；TFX-20.MC型紫外看胶仪，法国Milber Lourmat公司；SPH-2102C型立式双层恒温培养箱，上海世平实验设备有限公司；LX-B50L型高压灭菌锅，广州深化生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 霉豆渣中微生物的分离纯化

在225 mL灭菌生理盐水中加入25.00 g捣碎霉豆渣，震荡15 min，将混合液制成10-1～10-7稀释梯度，取10-3～10-7稀释液200 μL，分别倾注在PDA和YDP琼脂培养基上30 ℃培养3 d、MRS和LB琼脂培养基上37 ℃培养2 d。挑取不同类型菌落，用平板划线对菌株进行纯化，获取菌株纯培养物。使用少许无菌生理盐水冲洗霉菌纯培养物，获得混合液，用无菌棉花过滤混合液，得到的滤液为霉菌孢子悬浮液；在含600 μL 60%无菌甘油（V/V）的甘油管中分别加入300 μL细菌、酵母菌、霉菌孢子悬浮液，并分别储藏在-80 ℃冰箱中。

1.3.2 细菌的分子生物学鉴定

细菌DNA采用Goldenberger等[25]所述的SDS法提取。PCR扩增反应中，引物为：27f和1492r：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′和5′-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3′；体系为：2×Taq Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L引物各0.25 μL，模板0.5 μL，dd H2O补足至25 μL；条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共运行30个循环；72 ℃ 5 min。

1.3.3 真菌的形态学鉴定

观察并记载真菌纯培养物的菌落形态、表面状况、气味、颜色、菌丝长度及生长状况等；并分别用美蓝和乳酸石碳酸棉兰染液对酵母菌和霉菌染色，镜检查看酵母菌和霉菌的细胞形态。依照《真菌鉴定手册》[26]和《酵母菌的特征与鉴定手册》[27]对真菌进行形态学鉴定。

1.3.4 真菌的分子生物学鉴定

Ezuq柱式酵母基因组DNA试剂盒（Sangon Biotech）提取酵母菌DNA；霉菌在获得纯培养物后，直接送至Sangon Biotech进行霉菌基因提取及测序。引物为ITS1和ITS4：5′-TCCGTAGGTGAACCTGC GC-3′和5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，PCR反应体系及条件与细菌16S rRNA一致。

1.3.5 微生物分支系统发育分析

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，将含有目标条带的产物送至Sangon Biotech测序。将细菌和真菌测序结果分别在https://www.ezbiocloud.net/identify和https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上对比，获得近似序列，并通过MEGA 5.2软件构建Neighbor-Joining系统发育树。

1.3.6 发酵豆渣制备

新鲜豆渣121 ℃灭菌15 min，在无菌条件下，接种白地霉J1和霉菌孢子（总状横梗霉Z1和伞房横梗霉Z2），孢子数量采用血球计数板测定，以1:1:1比例接种到灭菌豆渣中，接种量为1×107cfu/g，接种混菌的豆渣置于30 ℃恒温培养0、1、2、3、4、5、6、7 d。待发酵终止后，将发酵豆渣样品放置于-60 ℃冰箱中，预冻24 h，再用真空冷冻干燥机干燥48 h，将冻干豆渣粉碎，置于干燥器内备用。

1.3.7 豆渣固态发酵过程中总酚与抗氧化活性测定

1.3.7.1 干豆渣总酚提取液的制备

称取粉碎干豆渣1.00 g，按料液比1:100加入80%甲醇，50 ℃水浴15 min，8000 r/min离心5 min，上清液为干豆渣总酚提取液。

1.3.7.2 总酚测定

参照福林酚法[28]测定豆渣总酚含量。取500 μL干豆渣提取液或一系列浓度的没食子酸（GAE）工作液（0、20、40、60、80、100 μg/mL），依次加入2.5 mL 10%福林酚溶液（V/V）、2.0 mL质量分数7.5%的Na2CO3溶液，常温保持1 h，在765 nm处测定吸光度，对照GAE标准曲线（y=0.0092x+0.051，R2=0.9997），换算出干豆渣总酚的含量，单位为mg GAE/10 g。

1.3.7.3 ABTS自由基清除率测定

参照Re等[29]的方法并略加修改。在50 μL干豆渣总酚提取液中，再加2.5 mL ABTS工作液，暗室反应5 min，于734 nm处测定吸光度，公式如下：

式中：

A0——将干豆渣总酚提取液换成蒸馏水的吸光值；

A1——干豆渣总酚提取液和ABTS工作液的吸光值；

A2——将ABTS工作液换成蒸馏水的吸光值。

1.3.7.4 DPPH自由基清除率测定

参照Akowuah等[30]的方法并略加修改。在500 μL干豆渣提取液中加入500 μL DPPH溶液（0.08 mg/mL，用无水乙醇溶解），暗室静置30 min，在517 nm处测定吸光值，公式如下：

式中：

A0——将干豆渣总酚提取液换成无水乙醇的吸光值；

A1——干豆渣总酚提取液与DPPH溶液的吸光值；

A2——将DPPH溶液换成无水乙醇的吸光值。

1.3.8 数据分析

干豆渣总酚提取液的总酚含量和抗氧化能力结果以Mean±S.D.表示，并利用GraphPad Prism 5.0软件绘制图形，SPSS 19.0软件进行方差分析，实验数据重复测定3次。

2 结果与讨论

2.1 霉豆渣中细菌的鉴定结果和系统发育进化树的构建

2.1.1 霉豆渣中乳酸菌的分子生物学鉴定结果

将测定结果与EzBiocloud收录的标准菌株DNA序列进行比对，经核酸同源性分析，将同源性97%以上的细菌16S rRNA序列，进行分支系统发育分析，由图1可知，从传统霉豆渣中分离了13株乳酸菌；如图1a所示，菌株R11、R12、R13与标准菌株戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）聚在一起，且菌株R11、R12、R13与戊糖乳杆菌的序列相似度也大于99%，证实菌株R11、R12、R13为戊糖乳杆菌；同理可知，菌株R21、R22、R23为乳酸片球菌（Pediococcus lolii），菌株R31、R32、R33为短乳杆菌（Lactobacillus brevis），菌株 R41、R42为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum），且均与其相对应标准菌株的序列相似度均大于99%。如图1b所示，分离得到的菌株R51、R52与标准菌株融合魏斯氏菌（Weissella confusa）在同一支上，且序列相似度大于99%，由此，R51、R52被鉴定为融合魏斯氏菌。

在食品发酵过程中，乳酸菌起关键作用，既能够改善发酵食品风味，又具有益生菌特性，可以增加发酵食品活性功能，是发酵食品中最常用的微生物[31]。Ogodo等[32]利用乳酸菌联合发酵豆粉，经测定发现淀粉体外消化率增加了8.75%，体外蛋白质消化率增加了8.16%，脂肪、糖类和粗纤维的含量均呈现降低趋势；证实豆粉用乳酸菌联合发酵后，可以改善其营养价值和消化率。

2.1.2 霉豆渣中芽孢杆菌的分子生物学鉴定结果

由图2可知，从传统霉豆渣中分离了6株芽孢杆菌，其中Y11、Y12、Y14、Y15为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、Y21、Y22为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。

芽孢杆菌具有潜在的益生功能，将其用于大豆及其制品的发酵有利于提高豆制品的营养价值，如Ali等[33]利用从韩国传统发酵豆制品清麴酱中分离得到一株枯草芽孢杆菌KCTC 13241，利用其发酵大豆制作清麴酱，结果表明，接种1%枯草芽孢杆菌KCTC 13241的清麴酱，其总酚含量达到最高为5.99 mg/g，DPPH清除率达到94.24%，ABTS清除率达到86.03%；显著提高了清麴酱的营养价值和抗氧化能力，证实枯草芽孢杆菌KCTC 13241具有潜在的益生功能；Kobayash等[34]用枯草芽孢杆菌发酵蒸煮大豆制作纳豆，与未发酵的蒸煮大豆相比，发酵过的蒸煮大豆其亚精胺增加了19.4%，精胺减少了19.4%，增加了发酵大豆的营养价值。

2.1.3 霉豆渣中葡萄球菌的分子生物学鉴定结果

由图3可知，从霉豆渣分离出葡萄球菌属9株，其中有6株松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri），分别为B11、B12、B13、B14、B15、B16；1株克氏葡萄球菌（Staphylococcus kloosii）B21；1株鸡葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum）B31；1株缓慢葡萄球菌（Staphylococcus lentus）B41。

葡萄球菌广泛存在于临床、食品制造、土壤等环境中，包含致病性、腐生性和食品工业发酵剂的菌株[35]。松鼠葡萄球菌和克氏葡萄球菌是机会致病菌，有感染人或动物的风险[36,37]。因此，食用自然发酵的霉豆渣，可能存在潜在的安全风险。研究表明，葡萄球菌不仅在肉制品的发酵过程中发挥着重要作用，而且影响发酵大豆及其制品的风味，大多数发酵豆制品中含量丰富的葡萄球菌[35]。Wu等[38]研究发现，在黄豆酱发酵过程中，葡萄球菌的含量最丰富。Jia等[39]研究发现，在豆瓣酱发酵过程中，葡萄球菌是引起豆瓣发酵和风味形成的优势菌群之一。霉豆渣中葡萄球菌是否会影响霉豆渣的风味及安全性有待进一步研究。

2.2 霉豆渣中真菌形态学与分子学鉴定结果

2.2.1 霉豆渣中霉菌的鉴定结果

菌株Z1菌丝体呈灰白色，质地丝绒状（图4a和表1）；镜检发现有大量分支丝状菌丝组成的菌丝体以及分生孢子梗末端形成近椭圆型的孢子囊，囊轴呈扁圆形（图4b）。根据形态学观察，初步将菌株Z1归为毛霉科真菌（Mucoraceae）。

将菌株Z1基因序列进行同源性序列搜索匹配（BLAST），菌株Z1与总状横梗霉（Lichtheimia ramosa）遗传距离最近，同源性达到100%（图4c）。结合Z1的生长及形态特征、序列相似性和构建的系统发育树，鉴定菌株Z1为总状横梗霉。有研究发现，总状横梗霉可以发酵水果渣、棕榈仁粉，可作为发酵食品和饲料的潜在菌[40,41]。

菌株Z2菌丝呈灰色，绒毛状（图5a和表1）；镜检下可清晰观测到分支丝状菌丝组成的菌丝体以及分生孢子梗末端形成的分生孢子，孢囊梗分支，末端形成近梨型或圆型的孢子囊，孢囊孢子多以球型呈现（图5b）；由细胞形态和菌落特征，初步将菌株Z2归为毛霉科真菌（Mucoraceae）。

由图5c可知，菌株Z2、Lichtheimia corymbiferastrain IDR1000026493（GenBank NO.JN638761.1）和Lichtheimia corymbiferastrain HBUM06896（GenBank NO.MF662344.1）三者处于同一分支，相似度为100%，鉴定Z2为伞房横梗霉。目前对于伞房横梗霉用于发酵食品的报道较为罕见。

2.2.2 霉豆渣中酵母菌的鉴定结果

结合菌株J1的菌落形态（图6a和表1）和镜检（图6b）可知，菌株J1有菌丝，且菌丝为横隔的真菌丝；有单个或链状的节孢子，形状为长筒型、末端钝圆；菌落四周近粉状，呈现乳白色，菌落中心有圆形凸起；初步将J1认定为地霉属（Geotrichum）。

将菌株J1基因序列进行BLAST，该片段与白地霉（Geotrichum candidum）的同源性达到100%。如图6b所示，菌株J1与Geotrichum candidumstrain S001（GenBank NO.KY486784.1）、Geotrichum candidumstrain YT5（GenBank NO.KY992078.1）、Geotrichum candidumstrain ATCC34614（GenBank NO.KU933412.1）、Geotrichum candidumstrain TR13.c（GenBank NO.KP017413.1）聚在同一分支上，鉴定菌株J1为白地霉（Geotrichum candidum）。白地霉能够将蛋白质和脂类转化成具有香气的化合物，因此在食品工业上白地霉不仅被泛用于辅助干酪成熟，更是食品和饲料发酵中常用的菌种之一[42,43]。如：刘天明等[44]利用白地霉发酵麦芽汁，制得的啤酒未检出乙醇、甲醇和甲醛，为无醇绿啤饮料。Noor-UI等[45]在日粮中添加白地霉饲喂异育银鲫，饲喂106CFU/kg和108CFU/kg白地霉实验组与对照相比，异育银鲫体重、饲料利用率和存活率显著提高（p＜0.05），证实白地霉是一种潜在的益生菌。

如图7a、图7b与表1可知，J2以两端出芽的方式繁殖，具有椭圆形态，菌落光滑蜡纸、呈现乳白色；初步鉴定为毕赤酵母属（Pichia）。图7c表明，菌株J2与库德毕赤酵母Pichia kudriavzeviistrain IFM53739（GenBank NO.LC389030.1）、Pichia kudriavzeviistrain IFM51979（GenBank NO.LC389007.1）、Pichia kudriavzeviistrain KDLYL17-1（GenBank NO.JX174414.1）在同一分支上，鉴定菌株J2为库德毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）。Junior等[46]以库德毕赤酵母和酿酒酵母复配发酵可可豆，与未发酵可可豆相比，总酚含量和甲基黄嘌呤显著增加（p＜0.05），提高了可可豆的抗氧化能力，增强了巧克力粉的品质和功能特性；证实了库德毕赤酵母可作为食品发酵剂。

结合霉豆渣中细菌和霉菌分子学鉴定结果可知，霉豆渣中微生物种类非常复杂，存在具有益生作用的乳酸菌和芽孢杆菌；以及可用于发酵食品或饲料的总状横梗霉、白地霉和库德毕赤酵母，但也存在条件致病菌：松鼠葡萄球菌和克氏葡萄球菌。在自然发酵的霉豆渣中，由于制作环境的开放性，可能会定植一定数量的致病菌，直接食用存在一定的风险性；且不同地区的霉豆渣受自然环境、制作方法、季节等影响，导致不同地区的霉豆渣中定植的微生物种类有所不同、菌群具有特异性；如徐书泽等[21]梧州霉豆渣中分离出1株粗糙脉孢菌；石威[47]从自制霉豆渣中分离酵母菌4株，分别为胶红酵母菌、圆形丝孢酵母菌、普鲁兰酵母菌、阿氏丝孢酵母菌，乳酸菌2株，分别为屎肠球菌和肠膜明串珠菌以及1株米根霉菌，以分离的7株菌混合发酵豆渣，制得色泽一致、游离氨基酸含量为11.64 mg/g，膳食纤维降低6.70 mg/g的发酵豆渣制品，改善了豆渣的食用特性。因此，从湖南邵阳霉豆渣中分离微生物是非常有必要的，为使用霉豆渣中分离的安全菌株发酵豆渣，生产规范化、工业化的霉豆渣及研制其他发酵豆渣制品打下基础。

2.3 豆渣固态发酵过程中总酚与体外抗氧化活性变化

本研究在前期试验分别以霉豆渣中分离得到的单一细菌或真菌菌株发酵豆渣，结果发现，经单菌发酵后的豆渣与未发酵豆渣相比，总酚含量和抗氧化能力均无明显变化（p＞0.05），单一菌株不能利用豆渣中营养物质。经多次试验，最终将白地霉J1、总状横梗霉Z1和伞房横梗霉Z2以1:1:1接种到灭菌豆渣中，接种量为1×107CFU/g，置于30 ℃培养箱中固态混菌发酵豆渣；结果表明，在未发酵豆渣（0 d）中总酚含量为17.57 mg GAE/10 g，发酵6 d达到最高，为134.35 mg GAE/10 g，总酚含量增长了116.78 mg GAE/10 g（见图8）。据Adetuyi等[48]报道，酚类化合物一般存在游离态或与糖苷结合两种形式，在发酵过程中，微生物分泌酶把酚类化合物转化成可溶性的游离酚。发酵7 d，豆渣总酚降至119.86 mg GAE/10 g，可能是由于随着发酵时间增加，豆渣中糖类物质减少，微生物开始利用酚类物质作为碳源，从而导致在发酵7 d时，豆渣酚类物质含量降低。酚类化学物具有抗氧化、抗炎症等生理活性，适当摄入富含多酚的食品，对保持和促进身体健康有利[49]。本研究结果表明，白地霉、总状横梗霉和伞房横梗霉混菌固态发酵豆渣有助于提高豆渣中酚类物质的含量。

如图9可知，在豆渣发酵过程中，ABTS清除率与总酚含量变化趋势大致相同，呈现先增后减。未发酵豆渣（0 d）ABTS自由基清除率为11.11%，在发酵6 d时达到最高为92.67%。ABTS自由基清除率结果表明，豆渣发酵有助于提高豆渣的抗氧化能力。

如图10可知，随着发酵时间的增长，DPPH清除率变化也呈现先增后减。未发酵豆渣（0 d）DPPH自由基清除率为23.47%，在发酵5 d时达到最高为79.98%，其中发酵3～7 d变化不明显（p＞0.05），与总酚及ABTS清除率变化趋势略有不同。研究表明，除了酚类物质会引起豆渣抗氧化能力提高之外，某些氨基酸的增加也可以增强抗氧化性活性，如组氨酸、色氨酸和苯丙氨酸都具有抗氧化活性[49]。因此，DPPH清除率在发酵3～7 d变化不显著，其原因可能是微生物发酵豆渣导致蛋白质分解，产生某些具有抗氧化能力的氨基酸有关。实验结果表明，利用微生物发酵豆渣后，其总酚含量和抗氧化能力显著提升，有利于豆渣营养价值的提高。

3 结论

湖南邵阳地区霉豆渣中分离纯化并鉴定出33株菌，其中乳酸菌有13株分别为戊糖乳杆菌、乳酸片球菌、短乳酸杆菌、发酵乳杆菌和融合魏斯氏菌；芽孢杆菌有7株分别为枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌；葡萄球菌9株，分别为松鼠葡萄球菌、克氏葡萄球菌、鸡葡萄球菌、缓慢葡萄球菌；真菌有4株，分别为总状横梗霉、伞房横梗霉、白地霉和库德毕赤酵母。本研究结果反映了霉豆渣中微生物的多样性，但由于自然发酵的霉豆渣因发酵环境的开放性和发酵条件的不确定性，使得霉豆渣产品质量受外界影响较大，产品安全性较低，定植了一定数量的条件致病菌：松鼠葡萄球菌和克氏葡萄球菌，直接食用霉豆渣可能存在安全风险。此外，以总状横梗霉、伞房横梗霉和白地霉混菌固态发酵豆渣后，其总酚含量和抗氧化能力大幅度提升，有助于将低成本的豆渣开发成食品或者动物饲料，增加豆渣的利用价值，减缓因豆渣废弃而引起的资源浪费。