电针对 STZ诱导的糖尿病神经痛大鼠脊髓小胶质细胞和 P2X4的干预作用

陈芷羽,胡群祺,马益琪,费雪瑜,李想,蒋晨琳,王涵芝,瞿思颖,方剑乔,何晓芬,蒋永亮

(浙江中医药大学第三临床医学院康复医学院,杭州 310053)

糖尿病神经痛(diabetic neuropathic pain, DNP)是一种常见的糖尿病并发症,属于典型的外周性神经病理性疼痛[1]。DNP常表现为对热和机械性刺激的敏感性增高。DNP症状可采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病鼠模型进行模拟,STZ诱导的糖尿病模型大鼠有较长的病程,造模后可出现显著的热痛和机械痛变化[2],有很多研究通过检测大鼠机械痛阈和热痛阈来评价DNP模型[3-4]。

小胶质细胞在调节DNP的形成中发挥着重要作用,已成为治疗 DNP的重要靶点[5]。脊髓中离子钙结合适配器分子(ionized calcium binding adapter molecule 1, Iba1)是小胶质细胞的标记物之一。脊髓背角离子通道型嘌呤能受体 P2X4(purinergic ligand-gated ion channel 4 receptor, P2X4R)在神经病理性痛痛觉过敏中起重要作用,P2X4R的表达下调,痛觉过敏症状明显减轻甚至逆转[6-7]。目前电针已被广泛用于治疗各种慢性疼痛,已有研究表明电针能缓解DNP[8-9],但其镇痛机制有待进一步明确和探究。已有研究表明,在坐骨神经慢性压迫性损伤模型中,电针可能通过下调P2X4R表达以提高大鼠热痛阈[10]。ZHENG Y等[11]研究表明电针可降低小胶质细胞P2X4R的高表达缓解 L5脊神经结扎诱导的神经病理痛,但电针对DNP模型大鼠脊髓P2X4R的干预作用有待研究。因此本实验通过建立DNP大鼠模型来探讨电针镇痛是否与其有效干预脊髓背角小胶质细胞和P2X4R表达有关。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠20只,体质量(200±50)g,由中国科学院上海实验动物中心动物科学实验中心提供,许可证号为SCXK(沪)2018—0006。大鼠在12 h明暗交替、温度20～25 ℃、湿度45%～55%的环境中饲养,允许大鼠自由摄食和饮水。适应性喂养7 d后开始实验操作。实验过程中所有的操作严格遵守《关于善待实验动物的指导性意见》中对实验动物进行处置的相关规定。

1.2 实验试剂与仪器

链脲佐菌素(S0130,美国Sigma),兔抗Iba1抗体(ab178846,英国 Abcam),兔抗 P2X4抗体(APR-002,以色列 Alomone),山羊抗兔二抗(7074,美国 CST),韩氏穴位神经刺激仪(HANS-200E,南京济生医疗科技有限公司),足底热痛仪(37370,意大利 Ugobasile),血糖仪(德国 Roche Diagnostics GmbH),纯水仪(美国Thermo Fisher Scientific),全波长酶标仪(美国Molecular Devices),电泳仪(美国 Bio-Rad),转印仪(美国 Bio-Rad),凝胶成像仪(美国 Bio-Rad),移液器(德国Eppendorf),pH计(瑞士METTLER TOLEDO)。

1.3 分组与模型制备

将20只大鼠随机选取6只作为对照组,对其余14只大鼠禁食16 h后参照KAUR N等[12]造模方法予以腹腔注射STZ溶液(65 mg/kg),监测大鼠体质量、空腹血糖和热痛阈。空腹血糖值≥16.7 mmol·L-1,热痛阈下降≥15%以上[13-14]则表示DNP造模成功。DNP造模成功的大鼠有12只。对照组大鼠予以注射等量的柠檬酸钠缓冲液。

1.4 干预方法

电针干预于造模后第 14天开始,选取自制的布套[15]将大鼠予以固定,根据邰昭霞等[16]实验大鼠选穴依据,选取大鼠膝关节后外侧,在腓骨小头下5 mm的足三里穴和大鼠后肢外踝尖与跟腱之间凹陷处的昆仑穴。用规格为0.25 mm×13 mm的针灸针进行针刺,并连接电针仪进行电针干预,电针频率为 2 Hz,强度为1～2 mA,每次治疗30 min,每日1次,连续电针7 d。对照组和模型组大鼠于电针组干预的相同时间段不做任何干预,仅予以固定,每次固定 30 min,连续固定7 d。

1.5 指标检测

1.5.1 空腹血糖测定

用尾静脉采血检测各组大鼠的空腹血糖,并在0 d、7 d、14 d、21 d测大鼠的体质量。

1.5.2 热痛阈测定

参照FEI X Y等[17]测定大鼠热痛阈的方法,待大鼠安静后采用足底热痛仪照射大鼠足底中部直至其产生抬足、舔足的反应时间,记作热痛阈。检测大鼠0 d、7 d、14 d、21 d足跖热痛阈。

1.5.3 脊髓组织中Iba1和P2X4R蛋白表达检测

参考杜俊英等[18]取大鼠脊髓背角的方法,腹腔注射戊巴比妥溶液麻醉大鼠并对其进行开胸,用生理盐水快速灌注左心室及升主动脉至大鼠肝脏发白。将大鼠开背置于冰上,剪断脊柱两旁的肋骨,剪取L4节段以上约5 cm的脊柱,用50 mL注射器冲出脊髓,留取中间膨大区域并用刀片切取大鼠脊髓背角,放置超低温冰箱保存备用。用Western blot法检测小胶质细胞标记物Iba1和P2X4R蛋白表达。取出大鼠脊髓背角,加入裂解液,匀浆后离心。用BCA试剂盒进行蛋白定量检测,再进行SDS-PAGE凝胶电泳,将分离的蛋白电泳至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭,加入一抗,稀释比依次为兔抗 Iba1(1:1 000),P2X4R(1:1 000),内参β-actin抗体(1:5 000),4 ℃过夜。TBST洗涤3次后加入山羊抗兔二抗孵育1 h,用TBST洗涤3次,最后用ECL显影。应用Image J软件对结果进行图像分析,计算目的蛋白与β-actin的灰度比值。

1.6 统计学分析

采用SPSS22.0软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示;重复测量数据采用多次重复测量方差分析方法分析,其余数据采用单因素方差(one-way ANOVA)分析;若方差齐,组间两两比较采用LSD法,若方差不齐则采用Dunnett’s T3分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量变化

各组大鼠 0 d体质量比较,差异无统计学意义(P＞0.05);与对照组比较,模型组和电针组大鼠在7 d、14 d、21 d体质量明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较,电针组大鼠在7 d体质量上升,差异有统计学意义(P＜0.05)。详见图1。

图1 各组大鼠体质量变化情况

2.2 各组大鼠空腹血糖变化

各组大鼠 0 d空腹血糖比较,差异无统计学意义(P＞0.05);与对照组比较,模型组和电针组大鼠在7 d、14 d、21 d空腹血糖明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01)。详见图2。

图2 各组大鼠空腹血糖变化情况

2.3 各组大鼠热痛阈变化情况

各组大鼠0 d和7 d热痛阈比较,差异无统计学意义(P＞0.05);与对照组比较,模型组大鼠在14 d、21 d热痛阈明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01);与对照组比较,电针组大鼠在14 d热痛阈明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较,电针组大鼠在21 d热痛阈明显升高(P＜0.01)。详见图3。

图3 各组大鼠热痛阈变化情况

2.4 各组大鼠脊髓Iba1、P2X4R蛋白表达水平

与对照组比较,模型组Iba1、P2X4R蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较,电针组Iba1、P2X4R蛋白表达显著减少,差异有统计学意义(P＜0.05)。详见图4、图5。

图4 各组大鼠脊髓Iba1蛋白表达情况

图5 各组大鼠脊髓P2X4R蛋白表达情况

3 讨论

糖尿病是严重危害人类健康的慢性疾病之一[19],糖尿病神经痛(DNP)是其常见的并发症之一[20]。DNP在临床上表现为肢体疼痛、感觉减退、麻木、灼热、冰凉等,也可表现为自发性疼痛、痛觉过敏、痛觉超敏,甚至发展至糖尿病足溃疡或需要截肢,严重影响患者生活质量。STZ可诱发糖尿病[21],它可通过破坏胰岛β细胞,导致血糖升高[22]。本实验采用单次腹腔注射STZ诱导DNP大鼠模型,STZ注射后大鼠出现体质量下降,空腹血糖明显上升,在STZ注射2周后热痛阈下降,且持续至模后3周,说明DNP造模成功。

足三里为足阳明胃经的合穴,《灵枢·五邪》:“邪在脾胃,则病肌肉痛,阳气有余,阴气不足,则热中善饥;阳气不足,阴气有余,则寒中肠鸣腹痛;阴阳俱有余,若俱不足,则有寒有热,皆调于三里。”由此可见,除了本经的作用养胃健脾,足三里还可以镇痛、平衡阴阳。有研究证明针刺足三里可以提高痛阈[23],临床治疗急性肾绞痛[24]、癌痛[25]、肩周炎[26]、三叉神经痛[27]效果显著。昆仑为足太阳膀胱经的经穴,《针灸大成》中提到“昆仑主腰尻脚气,足腨肿不得履地,鼽衄,腘如结,踝如裂,头痛,肩背拘急,咳喘满,腰脊内引痛……”,可见昆仑对身体各部有镇痛作用,临床多用来治疗腰扭伤[28]、坐骨神经痛[29]、眉棱骨痛[30]等,近年来在无痛分娩[31]方面也取得了成效。更有研究发现,电针下肢穴位镇痛效果比上肢更明显[32],故本实验选取足三里和昆仑二穴治疗DNP。研究结果表明,电针可提高DNP大鼠的热痛阈。

研究发现鞘内注射小胶质细胞抑制剂米诺环素[33]和P2X4R拮抗剂可抑制脊髓小胶质细胞和P2X4R的表达[4]。小胶质细胞源性脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的合成与释放与P2X4R密切相关[34-35]。周围神经损伤后,P2X4可通过刺激小胶质细胞释放 BDNF作用于脊髓背角神经元的酪氨酸激酶B受体参与神经痛[36]。王英等[37]研究表明,电针能够通过调节神经元内生物活性物质的合成与释放以发挥镇痛效应。ZHENG Y等[38]研究还发现电针可通过下调大鼠脊髓P2X4R缓解神经病理性疼痛。课题前期研究[39]表明,电针可能通过抑制DNP大鼠脊髓背角小胶质细胞表达和 BDNF的表达发挥镇痛作用。故本课题进一步探究电针治疗DNP除了与下调DNP大鼠脊髓小胶质细胞BDNF有关以外,是否还与其有效干预脊髓小胶质细胞和 P2X4R有关。研究结果表明,STZ注射后模型组大鼠脊髓背角上小胶质细胞和P2X4蛋白表达增多,电针可下调其蛋白表达。

综上所述,低频电针能有效改善糖尿病神经痛,可能与其有效干预脊髓小胶质细胞和 P2X4蛋白表达有关。