电针对绝经后骨质疏松症模型大鼠肠黏膜维生素D膜相关性快速反应类固醇结合蛋白表达的影响

石娜,朱崇田,欧阳钢

(1.临沂市人民医院,临沂 276003;2.江苏省老年病医院,南京 210024)

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PMOP)是绝经后女性的常见疾病,发病率为25%～50%,多发生在55～70岁或绝经后5～10年内[1]。患者可出现全身乏力、骨痛等症状,且极易发生骨折[2]。骨质疏松性骨折是老年患者致残和致死的主要原因,严重影响患者的生活质量,并增加了家庭和社会的负担[3]。目前西医主要以激素替代疗法为主,但不良反应多,且有致癌的风险[4]。针灸可有效提高患者骨密度及雌激素值,是一种安全有效的治疗方法[5-6]。研究发现,伴有消化系统疾病的患者其骨质疏松发生率明显增高[7-8],这与钙的吸收下降密切相关。1,25维生素D3膜相关性快速反应类固醇结合(membraneassociated rapid response steroid-binding,1,25D3-MARRS)蛋白和甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone-related protein, PTHrP)为胃肠道内存在的特异性蛋白,二者结合后可促进小肠黏膜Ca2+的吸收,对PMOP的防治具有重要作用[9-10]。本研究拟通过观察去卵巢大鼠肠黏膜1,25D3-MARRS表达与血清PTHrP、1,25(OH)2D3水平的变化,探讨电针对钙吸收的调节作用以及电针治疗绝经后骨质疏松症的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雌性 SPF级 3月龄 SD大鼠 32只,体质量 180～200 g,未曾交配,购于浙江省实验动物中心[许可证号 SCXK(浙)2014-0001]。在南京中医药大学实验动物中心(屏障环境)喂养,环境温度21～25 ℃,湿度40%～60%,光照时间每日12 h,饲养期间大鼠自由摄食饮水。动物喂养及实验方案通过南京中医药大学伦理审查(伦理批号201812A023)。

1.2 主要试剂与仪器

MEDIX90双能 X线骨密度检测仪(法国奥斯托公司),雷勃尔离心机(北京雷勃尔离心机有限公司),Thermo ST16R低温离心机,RT-6000酶标仪(深圳雷杜公司)。胎牛血清(FBS,美国 Gibco公司,货号10099141),低糖DMEM培养基(美国Gibco公司,货号11054001)、小鼠ERP57单克隆抗体(美国Santa公司,货号sc-23886)、山羊抗小鼠IgG二抗(赛默飞公司,货号A-11008)、戊巴比妥钠购于德国默克公司(中国上海分装,货号 283256),ELISA试剂盒购于上海酶联生物公司。

1.3 分组与造模

大鼠适应性饲养1周后,随机分为空白组、假手术组、模型组及电针组,每组8只。模型组和电针组采用切除大鼠双侧卵巢的方法制备绝经后骨质疏松症模型[11]。采用3%戊巴比妥钠(按每100 g体质量0.1 mL)腹腔注射麻醉大鼠,局部去毛,取背侧改良切口,最下肋下缘一横指处与腰椎旁开一个半横指处的交点为切口中心,纵行切开 0.8～1 cm,于深部脂肪层中可发现粉红色卵巢,在子宫角处结扎后切除卵巢。假手术组仅切除卵巢周围少量脂肪组织。为防止抗菌药物对实验结果的影响,术后不予注射或局部应用任何抗菌药物。空白组大鼠不做任何处理。所有大鼠术后均自由摄食和饮水。

1.4 干预方法

造模后,电针组行电针干预。将大鼠装于自制锥形袋内进行针刺。取关元和双侧三阴交为一组穴位,肾俞和双侧后三里为另一组穴位。取穴方法均参照《实验针灸学》[12]中相关描述。每日取一组穴位,两组穴位交替进行。用0.25 mm×25 mm针灸针刺入穴位后,接韩氏电针仪对双侧三阴交或双侧肾俞进行电刺激,强度2 mA,疏密波,频率 2 Hz/15 Hz,电针 20 min。每日1次,每周连续治疗5 d,间隔2 d,共治疗12周。其余各组均不进行任何干预。

1.5 样本采集

采集标本前一晚8点开始禁食,不禁水。第2天使用3%戊巴比妥钠(按每100 g体质量0.1 mL)将大鼠进行腹部麻醉,将其置于无菌操作台上,打开腹腔,腹主动脉取血,离心得血清后置于-20 ℃冰箱保存。取完血后,从十二指肠起始端剪下约10 cm小肠,无菌生理盐水冲洗干净后,剪刀纵行剪开肠腔,用烤过的载玻片刮下肠黏膜,用锡铂纸包裹,迅速置于盛有液氮的容器中,-70 ℃冰箱冻存备用。大鼠放血致死后,剥离大鼠右侧股骨及胫骨,彻底去除肌肉及肌腱等组织,用生理盐水纱布包裹后放入EP管中,置于-20 ℃冰箱保存。

1.6 观测指标

1.6.1 骨密度

将大鼠离体股骨和胫骨自冰箱中取出,室温下静置30 min后,使用MEDIX90双能X线骨密度检测仪进行骨密度检测,进行数据分析,得出骨密度值。

1.6.2 血清钙、PTHrP、1,25(OH)2D3、OPG和 RANKL水平

使用ELISA法进行检测。按照说明书设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50 µL。分别设定空白孔和待测样品孔,在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40 µL,然后再加待测样品 10 µL。将样品加于酶标板孔底部,不能触及孔壁,轻轻晃匀,除空白孔外每孔加入酶标试剂100 µL,用封板膜封板后放至37 ℃温育60 min;揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每个孔内加满洗涤液,静置 30 s后弃去,重复5次,最后拍干;每个孔内先加入显色剂A 50 µL,再加入显色剂 B 50 µL,轻轻震荡混匀,37 ℃避光显色 15 min;每个孔内加终止液 50 µL,终止反应;在加终止液后15 min以内测定,以空白孔调零,450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。

1.6.3 肠黏膜1,25D3-MARRS蛋白的表达

使用Western blot法检测。根据试剂盒说明书提取总蛋白,煮沸使蛋白变性。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜后5%脱脂奶粉室温封闭2 h,ERP 57单克隆抗体(1:100)作为目的蛋白,β-actin(1:1 000)作为内参,4 ℃过夜。山羊抗小鼠二抗(1:10 000)37 ℃孵育 2 h,洗膜后显色,暗室内胶片曝光。采图后用Gel-pro软件图像数据分析灰度值。

1.7 统计学方法

采用SPSS25.0统计软件对数据进行分析处理。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析;方差齐性检验采用Leven法,若方差齐则采用LSD法进行两两比较,若方差不齐则采用Dunnett’T3法进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠股骨及胫骨骨密度比较

与空白组比较,模型组大鼠股骨、胫骨骨密度明显降低(P＜0.01);与假手术组比较,模型组股骨及胫骨骨密度降低(P＜0.01);与模型组比较,电针组大鼠股骨、胫骨骨密度升高(P＜0.05)。详见图1。

图1 各组大鼠股骨及胫骨骨密度比较(每组8只大鼠)

2.2 各组大鼠血清钙、PTHrP、1,25(OH)2D3、OPG和RANKL水平比较

与空白组比较,模型组和电针组血清 1,25(OH)2D3及 PTHrP水平明显降低(P＜0.01);与假手术组比较,模型组和电针组血清1,25(OH)2D3及PTHrP水平明显降低(P＜0.01);与模型组比较,电针组血清 1,25(OH)2D3及PTHrP水平明显升高(P＜0.01,P＜0.05)。与空白组比较,模型组和电针组血清 OPG水平明显降低(P＜0.01,P＜0.05);与假手术组比较,模型组血清 OPG水平明显降低(P＜0.01);与模型组比较,电针组血清OPG水平明显升高(P＜0.01)。与空白组比较,模型组和电针组血清RANKL水平明显升高(P＜0.01);与假手术组比较,模型组和电针组血清 RANKL水平升高(P＜0.01);与模型组比较,电针组 RANKL水平明显降低(P＜0.01)。与空白组比较,模型组血钙水平明显降低(P＜0.05);与假手术组比较,模型组血钙水平明显降低(P＜0.05);与模型组比较,电针组血钙水平明显升高(P＜0.05)。与空白组比较,模型组和电针组血清OPG/RANKL值明显降低(P＜0.01);与假手术组比较,模型组和电针组血清OPG/RANKL值降低(P＜0.01);与模型组比较,电针组 OPG/RANKL比值明显升高(P＜0.01)。详见图2。

图2 各组大鼠血清钙、PTHrP、1,25(OH)2D3、OPG和RANKL水平比较(每组8只大鼠)

2.3 各组大鼠肠黏膜1,25D3-MARRS蛋白表达的比较

与空白组和假手术组比较,模型组 1,25D3-MARRS蛋白表达明显降低(P＜0.01);与空白组比较,电针组1,25D3-MARRS蛋白表达明显降低(P＜0.05);与模型组比较,电针组 1,25D3-MARRS蛋白表达明显升高(P＜0.05)。详见图3。

图2 各组大鼠血清钙、PTHrP、1,25(OH)2D3、OPG和RANKL水平比较(每组4个样本)

3 讨论

钙是重要的骨矿物质元素,钙的减少和丢失是引起骨密度下降并最终导致骨质疏松的重要因素之一[13]。近端小肠(十二指肠和近端空肠)是钙吸收的主要部位,小肠黏膜病变或切除小肠后可导致骨密度下降,最终造成骨质疏松发病率增加[7-8],而这一过程受 1,25(OH)2D3、雌激素及甲状旁腺激素(PTH)等多种激素的调控[14-15]。

1,25(OH)2D3是维生素 D在体内的活性形式,它对人体钙磷代谢及骨骼系统的生长发育都有重要的作用[16-17]。破骨细胞的分化与功能也受1,25(OH)2D3的调控,当肠道钙的摄取明显下降时,1,25(OH)2D3会明显增多,通过增强骨吸收并抑制骨质矿化以维持血清钙正常水平[18]。1,25D3-MARRS是蛋白质二硫化物异构酶家族中的一员,可在小肠、肾、脑、骨等多种组织中表达[19-20],是 1,25(OH)2D3发挥作用的非基因组机制[21]。研究显示,1,25D3-MARRS可以促进小肠对钙的快速吸收。1,25(OH)2D3与小肠上皮细胞膜受体1,25D3-MARRS/ERp57结合后,先后激活磷脂酶 A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC),最终导致PLC释放[22],从而达到促进钙磷代谢的目的。大鼠去卵巢后 1,25(OH)2D3及 1,25D3-MARRS水平下降,会严重影响肠道钙的吸收,从而导致骨质疏松。电针治疗后血清 1,25(OH)2D3水平升高,肠黏膜1,25D3-MARRS表达也明显增加,这种变化有利于促进肠道钙的快速吸收,以促进骨形成,最终达到预防骨质疏松的目的。

PTHrP在人胃肠道黏膜中均有表达[23],可影响骨、肾、乳腺、胎盘等多种组织中的钙吸收,是一种起效快、副作用少的骨形成促进剂[24-25]。PTHrP通过与 PTH1R相互作用,刺激 IGF-1合成,促进成骨细胞合成代谢[26]。给小鼠注入PTHrP后可以刺激十二指肠钙吸收的增加,而胃泌素对十二指肠钙的吸收并没有作用[24]。另外,PTHrP缺失的小鼠出生后可出现头部软骨、肋软骨发育不良及牙齿萌出障碍,说明PTHrP在骨骼发育、成骨及破骨代谢过程中发挥着重要的作用[27-28]。大鼠去卵巢后血清 PTHrP水平明显下降,影响了成骨细胞合成及十二指肠对钙的吸收,导致骨密度下降,电针可有效提高PTHrP水平,改善骨密度。

OPG和RANKL是破骨细胞形成、分化和调节的关键因子,OPG和RANKL的表达是骨吸收与重建的重要因素[29-31]。OPG/RANKL系统在机体中处于动态平衡,当比值下降时,会引起一些骨代谢疾病,而当比值升高时,会减弱破骨细胞的分化成熟,有利于骨重建[32]。大鼠去卵巢后 OPG/RANKL比值明显下降,说明破骨细胞分化活跃,发生骨质疏松的风险性高。而电针可有效提高OPG/RANKL的比值,发挥骨保护的作用[33-34]。

《素问·宣明五气》提出“肾主骨”,认为骨质疏松症主要与肾关系密切;《素问·逆调论》中强调“肾者水也,而生于骨……不生则髓不能满,故寒甚至骨也”。因此,本研究主要选择具有补肾健脾作用的关元、三阴交、肾俞、后三里进行电针治疗。研究结果发现电针可有效提高血清1,25(OH)2D3及PTHrP水平,增加 1,25D3-MARRS蛋白表达,从而促进肠道钙的重吸收,最终达到升高骨密度,治疗骨质疏松的目的。另外,电针还可通过提高 OPG/RANKL的比值,减弱破骨细胞的分化,从而发挥骨保护作用。

综上,肠道钙吸收不良是罹患骨质疏松症的重要原因,而电针可促进肠道钙的重吸收,提高血钙水平,并可通过作用于 OPG/RANKL系统,最终实现防治骨质疏松症的作用。