垂盆草水提工艺及产地优选*

张 芹，钱 芳

（江苏省中医院药学部，江苏 南京210029）

垂盆草为景天科垂盆草Sedum SarmentosumBunge的干燥全草，有清热解毒、利湿退黄功效，临床用于治疗湿热黄疸、痈肿疮疡、小便不利等［1］，对药物性肝损伤、脂肪性肝病、病毒性肝炎等肝病有独特疗效［2-3］。垂盆草含黄酮类、生物碱、三萜等化学成分［4-5］，黄酮类为其主要有效成分［6］，具有保肝［7］、抗纤维化［8］、抗氧化［9］、抗炎［10］、抗胆汁淤积［11］等作用。垂盆草分布较广，所含化学成分受产地和采收季节影响较大［12-13］。临床应用垂盆草以汤剂为主。本研究中通过正交试验法优选垂盆草的水提工艺，同时测定不同产地垂盆草有效成分含量，为其药材资源的优选提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100 型高效液相色谱仪（含G1322A 脱气机、G1311A四元泵、G1316A柱温箱、G1314A VWD 检测器、Agilent ChemStation，美国Agilent 公司）；BP - 211D型电子分析天平（德国Sartorius公司，精度为0.01 mg）；Millipore-Q超纯水机（美国Millipore公司）。

1.2 试药

木犀草苷对照品（批号为111720 - 201501，含量99.30%）、槲皮素对照品（批号为100081 - 201610，含量97.4%）、异鼠李素对照品（批号为110860-201611，含量99.0%），均购于中国食品药品检定研究院；垂盆草饮片（编号G1-G12）来源及批号见表1，由江苏省中医院朱育凤主任中药师鉴定为正品；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

表1 垂盆草样品来源及批号Tab.1 Source and batch numbers of Sedi Herba

2 方法与结果

2.1 含量测定方法建立

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）- 0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～18 min时46%A，18～20 min时46%A→55%A，20～28 min时55%A，28～30 min 时55%A→46%A，30～35 min 时46%A）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：360 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.1.2 溶液制备

分别取木犀草苷对照品、槲皮素对照品和异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1 mL 含木犀草苷20.12 μg、槲皮素61.7 μg、异鼠李素98.4 μg的单一对照品溶液。分别取各单一对照品溶液适量，加甲醇稀释，制成每1 mL 含木犀草苷6.287 5 μg、槲皮素36.634 μg、异鼠李素9.225 μg 的混合对照品溶液。精密吸取垂盆草样品提取液（编号G1）1 mL，置具塞锥形瓶中，加甲醇-25%盐酸溶液（4∶1，V/V）混合液25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.3 方法学考察

系统适用性试验：取2.1.2项下混合对照品溶液和供试品溶液各10 μL，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，与对照品溶液相同位置处有相应色谱峰，理论板数按木犀草苷、槲皮素和异鼠李素峰计均大于3 000，分离度均大于1.5，基线分离良好。详见图1。

1.木犀草苷 2.槲皮素 3.异鼠李素A.混合对照品溶液 B.供试品溶液图1 高效液相色谱图1.Luteolin-7-O-glucosid 2.Quercetin 3.IsorhamnetinA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密吸取2.1.2项下混合对照品溶液3，5，10，20，30，40 μL，按2.1.1项下色谱条件进样测定，以各待测成分进样量为横坐标（X，μg），峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程，木犀草苷为Y1=13.245X1+ 7.082 6（r= 0.999 9，n= 6），槲皮素为Y2=126.67X2+ 76.721（r= 0.999 9，n= 6），异鼠李素为Y3=27.355X3+15.208（r=0.999 9，n=6）。结果表明，木犀草苷、槲皮素、异鼠李素进样量分别在0.018 9～0.251 5 μg、0.109 9～1.465 4 μg、0.027 7～0.369 0 μg范围内与峰面积线性关系良好。

检测限与定量限考察：精密吸取混合对照品溶液适量，分别以信噪比（S/N）为1∶3 和1∶10 时的质量浓度确定检测限和定量限。结果木犀草苷、槲皮素、异鼠李素的检测限分别为0.16，0.12，0.15 μg/mL，定量限分别为0.63，0.37，0.46 μg/mL。

精密度试验：精密吸取2.1.2项下混合对照品溶液适量，按2.1.1 项下色谱条件，1 d 内连续进样测定6 次，连续进样测定6 d，记录峰面积。结果木犀草苷、槲皮素、异鼠李素日内精密度的RSD分别为0.74%，0.58%，0.50%（n= 6），日间精密度的RSD分别为0.98%，1.01%，0.62%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液（编号G1），分别于室温下放置0，2，4，6，8，12 h 时按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果木犀草苷、槲皮素、异鼠李素峰面积的RSD分别为1.33%，1.27%，1.05%（n=6）。表明供试品溶液在室温下放置12 h内基本稳定。

重复性试验：精密吸取样品提取液（G1）适量，共6份，按2.1.2 项下制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果木犀草苷、槲皮素、异鼠李素峰面积的RSD分别为1.46%，1.19%，1.77%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取同一供试品溶液（编号G1），分别加入不同质量浓度的木犀草苷、槲皮素、异鼠李素对照品溶液适量，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.2 正交试验

2.2.1 试验设计

以煎煮时间（因素A）、煎煮次数（因素B）、加水量（因素C）为考察因素，以木犀草苷、槲皮素、异鼠李素的总含量为考察指标，采用L9（34）正交试验法，优选垂盆草水煎煮提取工艺。因素与水平见表3。

表3 因素与水平Tab.3 Factors and levels

2.2.2 试验结果

正交试验结果见表4，方差分析结果见表5。可见，仅因素B 对结果有显著影响，影响强度为B>A>C，最佳提取工艺为A2B3C1，即加8倍量水，煎煮3次，每次40 min。从节约能源和结合实际考虑，将煎煮次数减为2次。

表4 L9（34）正交试验结果（n=9）Tab.4 Results of the L9（34）orthogonal test（n=9）

表5 方差分析结果Tab.5 Results of ANOVA

2.2.3 验证试验

取样品（编号G1）50 g，精密称定，共3 份，按上述优选的工艺提取。结果木犀草苷、槲皮素、异鼠李素总含量的RSD小于1.10%，表明此水提工艺可行。详见表6。

表6 验证试验结果（μg/g，n=3）Tab.6 Results of the verification test（μg/g，n=3）

2.3 样品含量测定

取12 批次样品各适量，按优选工艺提取，得提取液样品，再按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.1 项色谱条件进样测定，记录峰面积。并计算木犀草苷、槲皮素、异鼠李素总含量，平行测定3 次。可见，编号G10，G11 提取液样品中3 种成分总含量较大。详见表7。

3 讨论

3.1 指标成分选择

垂盆草含有黄酮类、三萜类等化学成分，槲皮素、木犀草苷、异鼠李素为黄酮类主要化学成分。木犀草苷有调节胆固醇水平、抗炎、抗病毒等作用［14］，槲皮素有抗炎、抗菌、抗癌等作用，以三者为指标成分，可有效控制垂盆草药材的质量，以保证疗效［15-16］。

3.2 洗脱条件选择

本研究中参考2020 年版《中国药典（一部）》［17］方法，在色谱条件中以甲醇-0.4%磷酸溶液（45∶55，V/V）为流动相等度洗脱，但发现色谱峰不能完全分离。改为梯度洗脱后色谱峰分离较好，故选择梯度洗脱。

3.3 耐用性考察

预试验中曾使用Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Amethyst C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Hedera C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）测定样品含量，结果表明，色谱条件在一定范围内调整，含量均无明显差异。

3.4 水煎煮工艺

垂盆草临床应用多为汤剂，根据药材性质以及为保持传统汤剂的有效成分，多以煎煮制成［18］。其影响因素主要有浸泡时间、加水量、煎煮时间和煎煮次数等［19-20］，采用正交试验法逐一优化水提工艺［21］。1）浸泡时间，预试验中考察了样品浸泡0，30，60，90 min，发现浸泡与否对试验结果无明显影响，故正交试验时选择药材不浸泡。2）加水倍数，考察了加6，8，10，12倍量水，发现加6倍量水时指标成分含量略低，而根据方差分析结果来看，加水量对试验结果无显著影响，加8 倍量水含量最高，且更节约资源。因此，选择加8 倍量水。3）煎煮时间，根据药材性质，选择煎煮时间为30，40，60 min，结果表明煎煮时间对试验结果无显著影响，以煎煮40 min 时含量最高，故选择煎煮40 min。4）煎煮次数，选择煎煮次数为1，2，3次进行试验，结果发现，由煎煮1次的效果明显劣于2次或3次，而煎煮2次与3次时样品含量差异较小。从节约能源和生产实际考虑，选择煎煮2次。验证试验结果表明优选的工艺合理、可行。

3.5 不同产地药材样品含量测定

中药材的成分含量不同，会影响临床药效。不同产地垂盆草中木犀草苷、槲皮素、异鼠李素的含量存在较大差异，可能与产地的地理环境、雨水量、温度及采收加工等因素有关。本研究中发现，湖南（郴州、邵阳）产垂盆草样品含量较高，可根据实际情况按需选择。

综上所述，本研究中优选的水提工艺合理可行，可用于垂盆草的煎煮提取。湖南（郴州、邵阳）产垂盆草药材中木犀草苷、槲皮素、异鼠李素总含量较高，可根据需要优先选用。