miR-200b与miR-200c靶向DNA甲基转移酶对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响

廖年春， 张潇迪， 刘 珏

(南华大学衡阳医学院附属第二医院妇产科，湖南省衡阳市 421001)

卵巢癌是女性生殖系统发病率排名第2的恶性肿瘤，其病死率在妇科肿瘤中排第1位[1]。目前卵巢癌首选治疗方案为外科手术和术后以顺铂为基础的化疗，但治疗后有约60%的患者会出现临床复发且5年生存率小于45%，复发的主要原因是患者对顺铂产生了耐药性[2]。

miRNA是一种普遍存在于真核生物细胞中长度约为18～25个核苷酸的非编码小分子RNA[3]。miRNA的异常表达与肿瘤细胞的增殖、生长、侵袭和凋亡密切相关[4]。真核生物中存在3种甲基转移酶(DNMT1、DNMT3A和DNMT3B)，其中DNMT1主要起维持甲基化的作用,而DNMT3A和DNMT3B主要起形成甲基化的作用[5]。miRNA-200是一个较特殊的miRNA家族,其家族成员在多种肿瘤中参与调控DNA甲基化[6]。本文观察miR-200b与miR-200c靶向DNA甲基转移酶对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

人卵巢癌细胞株(A2780)和人卵巢癌顺铂耐药细胞株(A2780/DDP)购于长沙丽欣生物有限公司，1640培养基购于美国Gibco公司，胎牛血清购于以色列Biological Industries公司，青链霉素混合液(100×)、顺铂购于北京Solarbio公司。完全培养基即RPMI-1640培养基(含100 U/L青霉素和100 mg/L链霉素双抗)+10%胎牛血清(FBS)。

miR-200b、miR-200c、U6引物序列、miRNA第一链cDNA合成试剂盒购于上海生工，miR-200b mimics、miR-200c mimics及阴性对照物转染试剂购于吉玛基因，0.25%胰酶购于美国HyClone，lipo2000购于Invitrogen公司，二甲基亚砜(DMSO)购于德国Sigma-Aldrich，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B抗体购于CST公司，GAPDH抗体购于Bioworld公司，鼠二抗及兔二抗购于美国Sigma公司，miRNA提取分离试剂盒购于北京天根生化科技有限公司，PCR试剂盒购于赛默飞。

1.2 qRT-PCR检测miR-200b与miR-200c表达量

取对数生长期细胞，弃去原培养液，PBS清洗1～2次，miRNA提取分离试剂盒分别提取A2780、A2780/DDP细胞中总miRNA,采用miRNA第一链cDNA合成(茎环法)试剂盒进行逆转录获得cDNA。以cDNA为模板,用U6作为检测的内参基因，进行qRT-PCR测定细胞中miR-200b与miR-200c水平。引物序列：miR-200b正向引物序列：5′-GCGCATCTTACTGGGCAGC-3′，反向引物序列：5′-AGTGCAGGG TCCGAGGTATT-3′；loop-RT引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATA CGACTCCAAT-3′。miR-200c正向引物序列：5′-GCGCGTCTTACCCAGCAGT-3′，反向引物序列：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；loop-RT引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAC TGGATACGACCCAAAC-3′。U6正向引物序列：5′-AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG-3′，反向引物序列：5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′；loop-RT引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT TCGCACTGGATACGACAAA ATA-3′。PCR扩增条件如下：94 ℃ 30 s 1个循环，随后94 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40个循环。分别计算miR-200b与miR-200c的相对表达量，结果采用2-ΔΔCt方法分析。每孔设置3个平行样本,每组实验重复3次。

1.3 细胞转染及细胞分组

取顺铂耐药细胞株A2780/DDP于含10%FBS的RPMI-1640培养基中，在5%CO2、37 ℃饱和湿度条件下传代培养。将2.0×105个/mL的细胞接种于6孔培养板培养24 h后，在细胞达70%～90%左右按转染试剂说明书对A2780/DDP细胞株进行miR-200b mimics、miR-200c mimics及阴性对照转染，分为si-miR-200b组、si-miR-200c组、si-NC组,转染后放入恒温细胞培养箱中培养4～6 h后换液。转染后1～2天处理细胞行后续实验步骤。

1.4 MTT法检测细胞IC50值

在6孔板细胞转染24 h后，取对数生长期细胞,0.25%胰酶消化后移至离心管中,离心收集细胞并加入培养基制成单个细胞悬液。加200 μL细胞接种至96孔板中,使每孔细胞含量为2 000个,每样品设置7个平行浓度，加入浓度梯度0、5、10、20、40、80、160 μmol/L DDP 48 h后每孔加5 g/L MTT溶液,孵育4 h，继而每孔加150 μL DMSO并振荡5 min。酶标仪在492 nm处测定达到预定时间后的各孔光密度值(OD),用SPSS软件计算各组细胞IC50值。

1.5 Western blotting法检测转染后DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白表达水平

转染48 h后取各组细胞，在冰上进行提取蛋白操作，弃去原培养液，4 ℃预冷的PBS溶液洗2～3次，每孔加入蛋白裂解液200 μL(RIPA∶PMSF=100∶1)提取总蛋白，取部分蛋白溶液用于BCA测定蛋白水平，按配方配置8%分离胶，依次进行电泳、转膜、封闭，封闭2 h后分别加入DNMT1、DNMT3A和DNMT3B(均为兔单抗)蛋白稀释(1∶1 000)后的一抗，GAPDH作为内参稀释(1∶5 000)，4 ℃孵育过夜，12 h后，回收一抗，TBST摇床洗去残留一抗，10 min/次，洗3次，加入稀释的兔二抗(1∶5 000)，室温避光孵育2 h，TBST洗去残留二抗，10 min/次，洗3次，最后显影。计算DNMTs/GAPDH比值,即表示DNMT1、DNMT3A和DNMT3B相对表达水平。每组实验重复3次。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡率

各组细胞加入DDP室温孵育48 h，随后加入Annexin V-PE结合液混匀,避光室温孵育15 min。采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.7 统计学方法

应用SPSS25.0统计软件分析，组间比较采用方差分析及t检验，P<0.05为差异有统计学意义。应用Graph Pad Prism8统计绘图。

2 结 果

2.1 A2780和A2780/DDP中miR-200b与miR-200c的表达情况

miR-200b与miR-200c在A2780细胞株的表达量均明显高于A2780/DDP细胞株(P<0.05；图1)。

图1 A2780和A2780/DDP细胞株中miR-200b与miR-200c的表达量

2.2 转染后各组细胞IC50值情况

si-miR-200b组、si-miR-200c组IC50值明显低于si-NC组(P<0.05；图2)。

图2 A2780/DDP细胞株中各组IC50值比较

2.3 转染后各组细胞DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白表达水平情况

si-miR-200b组、si-miR-200c组DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白表达水平低于si-NC组(P<0.05；图3)。

图3 A2780/DDP细胞株转染后各组细胞中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白的相对表达量

2.4 转染后各组细胞凋亡率情况

转染后A2780/DDP细胞株的各组细胞随顺铂浓度的增加，凋亡率逐渐增加，但差异无统计学意义(P>0.05)。在相同浓度药物处理下，si-miR-200b组、si-miR-200c组凋亡率高于si-NC组(P<0.05)，而si-miR-200b组、si-miR-200c组无统计学意义(P>0.05；图4)。

图4 转染后各组细胞凋亡率的比较

3 讨 论

卵巢癌为妇科三大肿瘤之一，其治疗手段一直是研究热点，近几年的治疗手段也取得了不错的成果，但术后的顺铂耐药仍然是影响卵巢癌患者术后生存率的重要问题[7]。

miRNA直接或间接调节涉及药物代谢、药物运输、药物靶标和下游信号分子的基因的表达[8]。越来越多的研究表明，miRNA可以调节药物代谢酶和转运蛋白基因表达,改变肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，从而影响治疗效果[8-10]。Lee等[11]发现，miR-200家族在EEC中高表达，并可能在癌症生长中发挥重要作用，用抗miR-429转染可以增强EEC中顺铂的细胞毒活性。Sun等[12]发现，miR200家族可能通过ZEB1/pSMAD3下调MMP3，从而抑制了卵巢癌细胞的侵袭和转移。Lynch等[13]发现，miR-200c和miR-141在前列腺癌中的异常表达可能作为前列腺癌的诊断和预后方面的新型生物标志物或治疗干预的重点。本文实验通过qRT-PCR技术发现在人卵巢癌细胞株A2780中，miR-200b、miR-200c的表达均明显高于人卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP，通过细胞转染技术用miR-200b、miR-200c的模拟物对A2780/DDP细胞株进行转染，发现miR-200b、miR-200c能增强A2780/DDP细胞对顺铂药物的敏感性并增加A2780/DDP细胞的凋亡，表明miR-200b、miR-200c能增加卵巢癌细胞对顺铂药物的敏感性并逆转耐药细胞的耐药性。

近年来表观遗传学备受关注，主要包括异常DNA甲基化、组蛋白修饰表达谱以及非编码RNA表达等[9]。表观遗传改变可通过调节参与药物代谢和分布以及药物靶标的关键基因的表达来影响药物治疗，从而导致药物反应的个体差异。这些表观遗传学改变以及循环核酸的表观遗传学特征的发现，对药物治疗疗效的改变，甚至为个性化治疗提供生物标志物，特别是在癌症的治疗中[10]，具有不可忽视的潜力。DDNMT通常在各种癌症组织和细胞系中过表达。DNA甲基化是可逆的，因此DNMT是药物开发的重要表观遗传学靶标[14]。DNA高甲基化可能是获得对顺铂耐药性的分子机制之一[15]。癌症甲基化组中的多个DNA甲基化变化与耐药性的获得有关[15]。在耐顺铂的卵巢癌中观察到DNA甲基转移酶的显着上调[16]。本实验通过增加A2780/DDP细胞的miR-200b、miR-200c表达可显著抑制DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表达量。

本研究结果表明，增加miR-200b与miR-200c的表达可抑制DNA甲基酶的表达，增强顺铂耐药细胞A2780/DDP对DDP的灵敏度，增加卵巢癌细胞的凋亡，逆转耐药细胞株的耐药性。