Adiporedoxin对TNF-α诱导血管内皮细胞Integrin α4和Integrin β1表达的影响

苏 波， 杨咏梅， 刘政海， 何 慧， 苏 琦

(南华大学衡阳医学院 1.药学院药物药理研究所，2.基础医学院应用解剖与生殖医学研究所，3.肿瘤研究所，湖南省衡阳市 421001)

脂过氧化物酶(adiporedoxin，Adrx)是过氧化物酶-2(peroxiredoxin-2，PRDX-2)家族成员之一。最初发现其与破骨细胞分化相关，且具有抗氧化功能[1]。Adrx具有抗脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导巨噬细胞炎症因子表达作用[2]；He等[3]发现Adrx在人血管内皮细胞表达，且过表达Adrx抑制肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)诱导的血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)表达。

整合素(Integrin)在炎症反应中介导细胞间的相互作用和跨膜信号转导，Integrin异常表达与动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)、肿瘤发生和进展等有关[4-6]。本文研究Adrx对TNF-α诱导血管内皮细胞Integrin α4和Integrin β1表达的影响，证实Adrx在血管内皮细胞炎症反应中对Integrin α4和Integrin β1表达的调控作用。

1 材料和方法

1.1 试剂

人脐静脉内皮细胞系(human umbilical vein endothelial cell line，HUVEC)(Walkersville，MD公司)，EGM或EGM2(Lonza公司)，Total RNA Kit(Omega公司)，Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems公司)，SYBR荧光定量PCR检测试剂盒(ABI公司)，抗Integrin α4和Integrin β1抗体(Abcam公司)，TNF-α、抗Adrx和β-actin抗体(Sigma公司)，二抗和si-Adr(Santa Cruz公司)，Adrx质粒由本实验室构建[4]。

1.2 细胞培养与细胞转染

HUVEC在37 ℃、含5%CO2、饱和湿度条件下，置于EGM或EGM2(Lonza公司)培养基中培养。采用电穿孔方法将Adrx质粒和si-Adrx转染到HUVEC，24 h后用抗Adrx抗体检测Adrx蛋白，验证Adrx质粒和si-Adrx转染效率。建立Adrx过表达细胞株分为对照组、空载体和Adrx组；干扰Adrx表达分为Control、si-Control、si-Adrx组。过表达实验分为空载体组、空载体+TNF-α组、Adrx+TNF-α组；si-RNA干扰实验分为si-Control组、TNF-α组、si-Adrx+TNF-α组。

1.3 qRT-PCR

将提取的细胞总RNA逆转录合成cDNA；利用Primer Express 4.0设计引物，Integrin α4: F 5′-CAG GTT TAA AGC ATG GCC ACA-3′，R 5′-TGG CAT TGG CAT TGT GTA CC-3′; Integrin β1: F 5′-GCC GCG CGG AAA AGA TGA A-3′，R 5′-TGC TGT TCC TTT GCT ACG GT-3′; β-actin: F 5′-CTC TTC CAG CCT TCC TTC CT-3′，R 5′-AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG-3′。反应条件：95 ℃ 15 s，58 ℃20 s，72 ℃ 20 s，36个循环；实验重复3次，β-actin作为内参基因，采用2-ΔΔCT方法进行相对值的定量分析。

1.4 Western blotting检测

将0.5 mL裂解液加入收集的细胞，置于冰上超声20 min后，12 000 r/min离心10 min，提取上清液。取等量样本凝胶电泳后转移至PVDF膜，室温封闭1 h，4 ℃孵育一抗过夜，洗膜3次后孵育二抗1 h。用化学发光显影胶片，灰度扫描后以β-actin作为内对照进行数据分析，计算3次独立实验的蛋白相对表达量。

1.5 统计学分析

采用SPSS 13.0进行数据分析，两组间比较采用t检验，多组间比较用方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 TNF-α对HUVEC细胞Adrx和Integrin α4、Integrin β1表达的影响

用10 μg/L TNF-α处理细胞0、2、4、8、16、24 h，如图1所示。与0 h组比较，Adrx蛋白水平在2、4 h增高，8 h达到峰值(P<0.05)，16、24 h下降，而Integrin α4和Integrin β1表达水平呈时间依赖性上调；实验结果显示TNF-α诱导Adrx表达，但呈现先上调后下降的趋势，而Integrin α4和Integrin β1表达水平在Adrx下调后明显升高。

图1 TNF-α对HUVEC细胞Adrx、Integrin α和Integrin β1表达的影响

2.2 过表达Adrx对TNF-α诱导HUVEC细胞Integrin α4、Integrin β1表达的影响

将Adrx质粒转染HUVEC细胞24 h，Western blotting结果显示细胞高表达Adrx(图2A)。用TNF-α(10 μg/L)处理细胞16 h后，分别检测Integrin α4和Integrin β1的mRNA和蛋白水平。与单用TNF-α处理的细胞比较，Adrx+TNF-α处理组Integrin α4和Integrin β1的mRNA水平和蛋白表达量显著下降(图2)。

图2 过表达Adrx抑制TNF-α诱导HUVEC细胞Integrin α4和Integrin β1表达

2.3 下调Adrx对HUVEC细胞Integrin α4、Integrin β1表达的影响

将si-Adrx转染HUVEC细胞24 h，Western blotting结果显示si-RNA下调Adrx表达(图3A)。用TNF-α(10 μg/L)处理细胞16 h后检测Integrin α4和Integrin β1 的mRNA和蛋白水平。结果显示，与单用TNF-α处理的细胞比较，用si-RNA处理细胞后，TNF-α诱导细胞 Integrin α4和Integrin β1的mRNA水平明显上调(图3B)；si-RNA下调Adrx表达后，TNF-α诱导的Integrin α4和Integrin β1蛋白水平增加(图3C)。

图3 Adrx-si-RNA增强TNF-α诱导HUVEC细胞Integrin α4和Integrin β1表达

3 讨 论

Adrx又称为巨噬细胞集落刺激因子诱导激活的过氧化物酶-2类分子(PRDX-like 2 activated in M-CSF stimulated monocytes，PAMM)。Xu等[1]报道，在诱导骨髓单核细胞向破骨细胞分化时发现这个基因，并证实它是一种氧化还原调节蛋白。过表达Adrx可下调LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎性因子IL-1β、IL-6、IL-12表达，表明Adrx对炎症反应具有抑制作用[2]。

炎症刺激因子所致的血管内皮细胞功能失调与As发生发展密切相关，黏附分子表达增高是内皮细胞炎症反应的特征之一[7]。He等[3]证实，Adrx抑制TNF-α诱导的血管内皮细胞VCAM-1和ICAM-1表达，同时减少单核细胞与内皮细胞黏附。促炎细胞因子TNF-α促进内皮细胞Integrin α4和Integrin β1表达，后者介导内皮细胞炎症反应及As进展[8]。本研究发现，在用TNF-α处理细胞后Adrx表达先上调后降低，与He等[3]的研究结果一致；过表达Adrx可拮抗TNF-α上调Integrin α和Integrin β1表达，而用si-RNA干扰Adrx表达则增强TNF-α上调Integrin α和Integrin β1的作用，表明Adrx负调控Integrin α4和Integrin β1表达。

Adrx分子结构与PRDX-2相似，后者具有抗氧化和抗炎作用。在ApoE-/-小鼠As易感区内皮组织PRDX-2表达增高；在高胆固醇饮食喂养的ApoE-/-和PRDX-2-/-双敲除小鼠，内皮细胞黏附分子表达增加，单核细胞黏附增多并渗入主动脉内膜，从而加速As斑块形成，表明As发生与 PRDX-2 表达减少有关[9]。Adrx参与黏附分子和细胞因子的表达调控，它可能具有与PRDX-2相似的抗血管内皮细胞炎症反应的功能；在TNF-α诱导炎症反应的过程中，随着炎症进展Adrx表达下降可能导致其负调控Integrin α4、Integrin β1作用减弱，而Integrin α4和Integrin β1表达持续性增高可能促进内皮细胞炎症反应和As发展。

Integrin介导肿瘤细胞迁移和转移[10]。血管内皮细胞Integrin α4和Integrin β1在肿瘤细胞脑转移的早期表达增高，Integrin α4和Integrin β1功能阻断抗体可抑制肿瘤细胞脑转移[11]。VCAM-1在乳腺癌细胞表达异常增高，Integrin α4、Integrin β1与VCAM-1相互作用可促进乳腺癌细胞远处器官转移[12]。血管内皮细胞Integrin α4、Integrin β1与肿瘤细胞VCAM-1相互作用不仅介导细胞黏附，还可能增强肿瘤细胞经血管内皮细胞迁移能力。本实验结果表明，下调Adrx表达可促进TNF-α诱导血管内皮细胞Integrin α4和Integrin β1表达，过表达Adrx则能下调Integrin α4和Integrin β1。由此推测Adrx在血管内皮细胞与肿瘤细胞相互作用中发挥重要的调节作用，它可能通过下调Integrin α4和Integrin β1抑制内皮细胞与肿瘤细胞黏附、影响肿瘤细胞跨血管转移，而在内皮细胞炎症反应中Adrx表达下降可能导致Integrin α和Integrin β1上调，后者促进内皮细胞与肿瘤细胞黏附。

本研究证实，Adrx在TNF-α诱导血管内皮细胞Integrin α4和Integrin β1表达中起着负调控作用。目前，Adrx在血管内皮细胞炎症反应中对黏附分子表达的调控机制尚需进一步的研究。