何首乌中二苯乙烯苷的提取优化研究

蔡沙沙，曾裔腾，邓向点，张兴钰，何银银，张亚洲，邹树良

(1.贵州中医药大学何首乌研究中心，贵州 贵阳 550025；2.贵州理工学院食药学院，贵州 贵阳 550025)

0 引言

何首乌为来源于蓼科植物何首乌(Polygonum Multiflorum Thunb)的干燥块根，其性微温，味苦、甘、涩。在中医临床上应用于治疗高脂血症等相关的病证。何首乌广泛分布于黄河流域以南的各个省份，并且在贵州省已有较大面积人工种植地区，对何首乌的发展也必将会对贵州省中药种植产业起到一定有效推动[1-5]。

何首乌样品中化学成份较复杂，但与其功效相关的物质基础为其含有二苯乙烯苷和蒽醌类两类主要化学成份[5-7]。作为物质基础的一类是大黄素和大黄素甲醚为蒽醌类，已有的研究证实其是何首乌药材产生肝毒性的主要原因；而另一类则是二苯乙烯苷成份，其被认为在一定程度上具有对肝脏功能的保护作用。二苯乙烯苷实验应用总结中能够产生降血脂的作用，并在对抗衰老、抑制肿瘤等方面具有较好的生理活性，在当前老龄化的大情况下，对其进行研究有重要的现实实际意义[6-7]。

本研究拟通过对何首乌中所含有的二苯乙烯苷采用一定的提取方法进行有效的优化筛选，对提取过程中的影响因素进行考察，以期在一定程度与范围内优化出最佳的提取条件，将来为何首乌中二苯乙烯苷的开发利用提供实验依据[8]。

1 仪器与材料

仪器：高效液相色谱仪，Agilent 1260，安捷伦公司；色谱柱：phenomenex，Gemini，4.6 mm×250 mm，5 μm，51234-9，菲罗门公司；分析天平，BSA124S，赛多利斯科学仪器公司；烘箱、干燥器、称量瓶、托盘、小型打粉机和药典筛等。

试剂：HPLC级的乙腈，0201028；HPLC级的甲醇，20201017；乙腈与甲醇均购自科龙公司；其他试剂与提取用乙醇为分析纯试剂；实验用水为娃哈哈纯净水，20201121；二苯乙烯苷对照品，20200719，含量>99%，购于四川成都德思特公司。

材料：本次实验所选用的何首乌药材样品来源于合作单位铜仁市供销联社提供(批号：20180517)，切片晾干，如图1所示，收集日期为2018年4月7日，由贵州中医药大学张亚洲老师进行了其来源鉴定，确定为Polygonum multiflorum Thunb的干燥块根(按2020版《中国药典》中何首乌项下条件进行检测，二苯乙烯苷的含量为4.48%，药材含水份的量为11.92%；证明所选用的何首乌符合2020版《中国药典》中何首乌的要求，为合格药材)。

图1 铜仁-生何首乌

2 方法与结果

2.1 色谱条件

本次实验分析条件参考《中国药典》中何首乌项下要求进行，分析时的流速确定为1.0 mL/min，流动相使用水∶乙腈为80∶20的条件下进行，分析过程中进行等度分析，其检测时设定的检测波长为320 nm。

对照溶液配制：精密称取二苯乙烯苷对照品117.0 mg，依据配制原则进行配制，最后配制为浓度约0.234 mg/mL的溶液，10 μL进样，记录峰面积分析，结果如图2所示。

图2 二苯乙烯苷对照品溶液的色谱图

样品处理：按提取实验设计中的实验进行提取后，得到各次的实验所得溶液，用0.45 μm滤膜过滤该溶液后得滤液，再取以上滤液移取1 mL到10 mL量瓶中，50%乙醇至刻度摇匀后即得样品溶液，10 μL进样。色谱峰显示二苯乙烯苷能够获得较好的分离效果，如图3所示。

图3 何首乌样品的色谱图

2.2 分析指标成份的线性关系

标准曲线制定：精密称取所购含量符合要求的二苯乙烯苷对照品；万分之一天平精密读数为117.0 mg，在50 mL的量瓶中50%乙醇为溶液进行溶解并至刻度后摇匀即得M。

精密移取M中溶液为6.0，5.0，4.0，3.0，2.0，1.0，0.5，0.1 mL分别置于10 mL量瓶中，50%乙醇至刻度摇匀后即得各对照溶液，分别10 μL进样，记录色谱峰面积为纵坐标Y，以进样二苯乙烯苷的实际质量为横坐标X，X与Y两变量得到的回归方程为Y=3 378.38X+151.82(r=0.999 9)。

结果表明二苯乙烯苷的质量在0.234～7.020 μg的范围内与仪器检测时对应的峰面积有好的线性关系，符合含量测定时的相关标准曲线的规定要求。

2.3 何首乌中二苯乙烯苷的提取正交工艺考察

何首乌提取二苯乙烯苷采用50%乙醇为溶剂，取打粉过筛后备用何首乌样品30 g，提取时主要影响因素设定4个，每个因素下设3个水平，分别是提取的次数(1，2，3)、溶剂加入的倍数(12，10，10；10，8，8；8，6，6)、提取各次的时间(30，45，60 min)和是否需要浸泡的时间(浸泡0，0.5，1.0 h)进行，按L9(34)安排正交实验，提取溶液纱布滤过后合并使用，按上述2.1项下样品的溶液进行配制、分析，因素与水平如表1所示。

表1 因素与水平

由于选定二苯乙烯苷作为何首乌的提取研究对象，实验考察评价中选用二苯乙烯苷的含量作为分析评价指标，试验的具体安排和试验结果如表2所示，表2中，R为极差，Kn为实验指标值之和。对最后结果按方差分析进行统计分析后如表3所示。

表2 正交试验安排与结果

表3 方差分析

从选定的各个因素来看，方差分析结果表明其影响因素对二苯乙烯苷的提取均无显著的影响，但综合分析发现实际上的具体影响大小则为A>C>B。最后确定最优工艺为A2B3C2D3(即需要提取前浸泡1 h，加稀乙醇的量为12、10倍，提取的次数为2次，提取时间为60 min)。

此项研究结果的影响情况还应综合工业生产时的经济效益、社会效益、时间效益和人力成本等进行综合评估。

2.4 何首乌中二苯乙烯苷提取工艺的验证实验考察

验证实验：具体操作按所确定的最优提取方法进行提取。样品的配制按前述样品处理中方法进行。实验结果如表4所示。

表4 验证实验结果

对实验结果进行分析，结果表明其选取的优化提取条件对何首乌中含有的二苯乙烯苷的重复性、提取效率均达到了较好的效果，二苯乙烯苷的提取率达到95.74% (RSD为0.67%，n=3)。

3 结语

实验研究中极其重要的是对实验中的评价指标的合理选取，对何首乌的总结发现由于二苯乙烯苷是何首乌中关键的指标性成分，本工作的目的是优选有效条件来进行提取二苯乙烯苷，为后续研究需要大量二苯乙烯苷提供了有效可行的途径，所以本研究采用二苯乙烯苷的样品含量作为它们提取效率好坏的评价指标。

在实验操作中发现：药材的水份测定时要严格按要求进行，药粉厚度不要太厚，样品从烘箱中取出放在干燥器中时一定要快速，且称量时保持在干燥器中时间应尽可能一致，药材样品的保存上要做好防虫防潮。实验结果通过分析处理得出以下结论：

(1)提取过程中选定的影响因素均对提取效率表现为不显著影响，但是提取的次数中，提取2次与提取3次效果优于只提取1次的效果，提取2次与提取3次比较后发现其差异较不明显，为节省提取时间与溶剂考虑，选取的提取次数为2次。

(2)比较发现后选取提取溶剂加入量12、10倍量优于10、8倍及8、6倍，确定提取溶剂加入量为12、10倍。

(3)比较发现选取的提取时间60 min优于45 min和30 min，确定提取的时间为1 h。

(4)通过浸泡而提高提取效率有利于节省提取的溶剂和提取的能耗，其方法较为可取，对药材需要浸泡的时间，比较后选定了1 h 的浸泡时间较好。

验证实验结果重复性、平行性较好，也说明对何首乌中二苯乙烯苷提取时，在选定的影响条件下50%乙醇对指标成份的溶解性较好，提取效率也较高。本研究工作结果将为何首乌中活性成份二苯乙烯苷的开发与利用奠定前期的条件基础。