基于BMP2/Smad1/Runx2/Osterix 信号通路探讨健骨颗粒氯仿萃取部位对体外成骨细胞分化的影响

周 芬，孙雨晴，孙 攀，张楚天，杨 娟，林燕萍

福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122

成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，具有合成、分泌骨基质，并促使其矿化的功能，是维持骨形成和骨吸收动态平衡的关键因素［4］。研究显示：骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）是诱导成骨细胞分化的主要信号蛋白之一［5］，BMP2/Smad1/Runx2/Osterix 信号通路和成骨细胞的分化密切相关［6-8］。

本课题组前期研究发现健骨颗粒能够促进成骨细胞分化，促进骨形成，发挥防治绝经后骨质疏松症的作用［9-12］。为进一步阐释健骨颗粒复方的作用机制，本文基于前期研究基础，对健骨颗粒整方进行氯仿萃取，获得中药有效部分干预原代成骨细胞，从BMP2/Smad1/Runx2/Osterix 信号通路角度，探讨健骨颗粒氯仿萃取部位对成骨细胞分化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验药物 健骨颗粒主要药物组成：煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、党参、淮山药等，均从福建省医药公司采购，委托福建中医药研究院加工制备成含原生药2.9 g的粉末。

1.1.2 实验动物 BALB/c 小鼠8 只，年龄＜3 d，购自上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK（沪）2017-0005，用于原代成骨细胞的提取。

1.1.3 主要实验试剂 胰蛋白酶、DMEM 高糖培养基（新西兰Hyclone 公司）；碱性磷酸酶染色试剂盒（南京建成生物科技有限公司）；Noggin（美国Med‐Chemexpress生物科技公司）；氯仿（国药集团化学试剂有限公司）；DMSO 和Ⅰ型胶原酶（日本Sigma 公司）；RIPA 蛋白裂解液、PMSF、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、彩色预染蛋白maker（碧云天生物技术研究所）；BMP2、Smad1、Runx2、Osterix、ALP、Collagen Ⅰ以及β-actin 蛋白抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；MTT 试剂盒（南京凯基生物科技公司）；Trizol（美国invitrogen 公司）；YBR Premix Ex TaqTMPCR Kit（日本TaKaRa 公司）；BMP2、Smad1、Runx2、Osterix、ALP 与CollagenⅠPCR 引物（上海生物工程技术有限公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）。

1.1.4 主要实验仪器 倒置相差显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；LX-800 酶标仪（美国THERMO FISHER 公司）；GEL DOC 2000 凝胶成像系统（美国PE 公司）；实时荧光定量PCR 仪（美国Life technolo‐gies公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 健骨颗粒氯仿萃取部位的提取 将健骨颗粒粉末和蒸馏水等比例配成药液混合物，加入1/3混合物体积的氯仿混匀，静置分层后析出氯仿部位［13］。重复以上操作4次后，上层溶液较少，较难再萃取，故取前5 次所得的氯仿萃取部位。将氯仿萃取部位溶液旋转蒸发后，先水浴制成浸膏，再真空干燥成固体状，最大程度上减少残留在药物内的萃取剂。将制成的固体中药，按照每30 mg 中药1 mL DMSO配成母液，-20 ℃保存。

1.2.2 成骨细胞的提取及培养 采用无菌技术分离出乳鼠的颅盖骨，用预冷的PBS洗净，去除多余组织后移入含5 mL Ⅰ型胶原酶的培养皿中，将骨片剪碎，消化2 h，用移液枪吸取上清液装入离心管，离心后去上清，加入完全培养液，吹打均匀，按需接种于培养瓶，置入温度为37 ℃、CO2含量为5%的培养箱培养［14］。原代成骨细胞培养时，48 h 换液1 次，当细胞密度约为80%时进行传代，置入温度为37 ℃、CO2含量为5%的培养箱中培养，每日观察细胞生长情况。

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1.2.3 碱性磷酸酶染色法鉴定成骨细胞 取生长状态较好的第2 代细胞，收集后接种于24 孔板，密度以每孔1×105为标准。次日ALP固定液固定3 min弃液，PBS 清洗干净，ALP 孵育液避光湿孵1 h，PBS洗净，苏木素复染3 min，观察结果［15］。

1.2.4 MTT 法筛选最佳给药浓度 取生长状态较好的第2 代细胞，种入96 孔板，加入2、4、8、16、32、64 ng/mL 这6 个浓度的健骨颗粒氯仿萃取部位（每组设6 个副孔）进行干预，干预时间设置为1、2、3、4、5 d，干预结束后按量加入MTT，细胞培养箱孵育4 h，测OD值，并绘制相应的生长曲线。

1.2.5 细胞分组与干预 取生长状态良好的第2代细胞铺板，将细胞分为空白组、药物组、抑制剂组和抑制剂加药物组4组。用含10%胎牛血清的完全培养基进行培养，细胞长至80%时弃液，饥饿培养24 h后，空白组更换新的完全培养基培养，药物组、抑制剂组分别用含健骨颗粒氯仿萃取部位（最佳药物浓度的完全培养基和含BMP抑制剂Noggin 150 ng/mL）的完全培养基干预，而抑制剂加药物组先用含Noggin的完全培养基预处理2 h，再加入健骨颗粒氯仿萃取部位的完全培养基共干预，各组均培养48 h 后进行后续实验。

1.3 相关指标检测

1.3.1 RT-PCR 检测BMP2、Smad1、Runx2、Osterix及ALP、Collagen ⅠmRNA 的表达情况 细胞分组与干预如“1.2.5”所述，干预结束后弃培养基，PBS清洗2 遍，Trizol 法提取细胞总RNA，Nano Drop2000 检测提取物浓度，纯度需要维持在1.8～2.0 范围内。反转录方法根据反转录试剂盒说明书步骤依次进行，采用两步法中的实时荧光定量，SYBRTMGreen PCR 法扩增后，得到溶解曲线和扩增曲线，并将各组的相对mRNA 的含量进行比较，引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.2 Western blot 检测BMP2、Smad1、Runx2、Os‐terix、ALP、Collagen Ⅰ的蛋白表达情况 细胞分组与干预同RT-PCR，干预结束后提取成骨细胞总蛋白并用BCA 定量法测定具体蛋白浓度，把蛋白样品依次加入相应的凝胶泳道内进行电泳，电泳结束后，用湿转法转膜。封闭2 h，TBST 洗涤后加入一抗4 ℃过夜。次日TBST 摇洗后二抗孵育2 h，再次洗涤后显影，用ImageLab 4.0 软件处理分析各组蛋白条带。

1.4 统计学方法

选用SPSS 21.0版软件分析处理所有实验数据，并用（）的格式表示具体结果；当符合正态分布时，选用单因素方差分析；当不符合时选用Kruskal-Wallis 秩和检验分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成骨细胞分离培养及鉴定

2.1.1 观察成骨细胞形态 第1代成骨细胞接种于培养瓶贴壁后，由均一的小球形变成菱形、多角形、梭形等多种形态，当细胞密度达80%时进行传代。观察发现第3 代细胞状态最好，故本实验选用第3代细胞作为实验对象，见图1。

图1 第1～3代成骨细胞贴壁生长形态Figure 1 Adherent growth morphology of osteoblasts in the 1-3 generation

2.1.2 成骨细胞鉴定 碱性磷酸酶染色结果提示所提取原代细胞阳性率＞90%，经鉴定确认所培养细胞为成骨细胞，见图2。

图2 原代成骨细胞碱性磷酸酶染色（×200）Figure 2 Alkaline phosphatase staining of primary osteoblasts(×200)

2.2 最佳给药浓度选择

经MTT 法检测成骨细胞增殖，结果显示：与空白组对比，6个实验药物浓度（分别是2、4、8、16、32、64 ng/mL）在干预后第1～2 天均可促进成骨细胞增殖，当药物浓度为32 ng/mL，干预时间为2 d 时，成骨细胞的增殖速度最快，故选择32 ng/mL 干预2 d作为健骨颗粒氯仿萃取部位的最佳干预条件，干预原代成骨细胞并进行后续实验，见图3。

图3 不同浓度药物干预后细胞生长曲线Figure 3 Cell growth curve after drug intervention at different concentrations

实验还发现，当药物浓度为0～2 ng/mL 时，细胞生长高峰在3～4 d；当药物浓度为4～64 ng/mL时，第2天就已到达生长高峰。由此可见，适当浓度的健骨颗粒能使成骨细胞生长高峰期提前，见图4。

图4 不同干预时间各药物浓度组成骨细胞增殖情况Figure 4 Osteocyte proliferation at different drug concentrations at different intervention time

2.3 4 组成骨细胞BMP2、Smad1、Runx2、Osterix、ALP和Collagen Ⅰ基因表达水平比较

BMP2、Smad1、Runx2、Osterix、ALP、Collagen Ⅰ的基因表达检测结果显示：与空白组比较，抑制剂组以上6个指标基因表达量均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），药物组以上6 个指标基因表达量均显著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。与抑制剂组比较，抑制剂加药物组以上6 个指标基因表达量均较高（P＜0.05或P＜0.01），见图5。

图5 4组BMP2、Smad1、Runx2、Osterix、ALP、Collagen ⅠmRNA表达水平比较Figure 5 Comparison of mRNA expression of BMP2,SMAD1,Runx2,Osterix and Collagen Ⅰin four groups

2.4 4 组成骨细胞BMP2、Smad1、Runx2、Osterix、ALP和Collagen Ⅰ蛋白表达水平比较

与空白组比较，抑制剂组以上6 个蛋白表达量均显著降低（P＜0.05 或P＜0.01），药物组以上6 个蛋白表达量均显著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。与抑制剂组比较，抑制剂加药物组以上6 个蛋白表达量均较高（P＜0.05或P＜0.01）。见图6～7。

图7 Western blot检测4组成骨细胞蛋白表达水平Figure 7 Protein expression of osteoblasts in four groups detected by Western blot

3 讨论

绝经后雌激素水平下降导致成骨分化减少，骨吸收大于骨形成，骨稳态失衡是绝经后骨质疏松症的重要病因之一［16-17］。成骨细胞分化作为骨形成的关键环节对骨质疏松症的防治十分重要，因此，促进成骨细胞分化可以作为阐释中药防治PMOP的切入点［18］。中药临床治疗多以复方为主，复方药物种类多，成分复杂，直接水提干预体外细胞，复方的药效会受到干扰和限制［19］。为了使实验更加科学和严谨，本实验采用中药有效部位提取技术，使用有机溶剂氯仿将健骨颗粒整方萃取，得到效应成分更为富集的化学物质，进行体外细胞实验。既往研究发现氯仿从中药中萃取的木脂素成分属于植物雌激素，在体内的分解产物与雌激素的结构类似，能够促进成骨细胞分化［20］。本实验研究发现，适当浓度的健骨颗粒氯仿萃取部位不仅可以提高成骨细胞增殖速率，同时还能使成骨细胞生长高峰期提前。当成骨细胞增殖速度加快，数量增多形成多层细胞，并合成、分泌Ⅰ型骨胶原蛋白时，能够为最终矿化形成骨结节提供条件。细胞增殖到一定程度后开始分化，分化早期主要合成分泌ALP，从而促进骨基质的矿化。本实验研究结果表明，药物组Col‐lagenⅠ、ALP 基因和蛋白的表达量比空白组明显升高，说明健骨颗粒氯仿萃取部位能够有效促进成骨细胞分化。

BMP2 信号通路是成骨分化的关键调节剂［21］。BMP2 与其受体结合，诱导Smad1/5/9 的磷酸化，激活的Smads 转移到细胞核中可以调节目标基因，如Runx2 和Osterix。Runx2 是成骨细胞分化所必需的主转录因子，可协同其下游的Osterix 调节成骨细胞特异性基因（如ALP、CollagenⅠ）的表达［22-23］，从而影响成骨细胞分化。本研究结果显示，与空白组相比，药物组BMP2、Smad1、Runx2、Osterix 基因和蛋白的表达量都有明显升高趋势，且ALP、CollagenⅠ的基因和蛋白表达量随BMP2 升高而同步上升，提示健骨颗粒氯仿萃取部位可能通过上调BMP2 促进成骨细胞分化。

Noggin 是一种分泌型糖蛋白，由205 个氨基酸组成，是骨形态发生蛋白（BMPs）的拮抗剂。Noggin可与BMP2 特异性结合，阻断后者的受体结合位点，从而抑制BMP2 的信号转导作用［23-24］。为了明确健骨颗粒氯仿萃取部位是否通过调控BMP2/Smad1/Runx2/Osterix 信号通路达到促进成骨细胞分化的作用，实验使用BMP2 抑制剂（即Noggin）抑制成骨细胞内BMP2信号转导作用，Noggin 作为BMP2的抑制剂能够明显抑制其下游的Smad1、Runx2、Osterix基因和蛋白的表达，且ALP 与Collagen Ⅰ基因和蛋白的表达量则随着BMP2 信号通路相关蛋白和基因表达下降而下降［25］。同时，设置抑制剂加药物组（Noggin和健骨颗粒氯仿萃取部位共干预）同药物组进行反向对比，药物组BMP2、Smad1、Runx2、Osterix的基因和蛋白的表达量均明显升高，且成骨细胞分化指标ALP 与CollagenⅠ基因和蛋白表达量同步升高。此外，实验结果显示抑制剂加药物组BMP2、Smad1、Runx2、Osterix 的基因和蛋白的表达量对比抑制剂组仍然有着明显的提升，说明健骨颗粒氯仿萃取部位有效干扰了Noggin 的抑制作用，其机制可能是药物干扰Noggin 与BMP2 的结合，减弱了Nog‐gin的抑制作用，但其详尽机制尚有待进一步深入探讨。本实验结果提示，健骨颗粒氯仿萃取部位能通过调控BMP2/Smad1/Runx2/Osterix 通路促进成骨细胞分化，增加骨形成，从而达到防治绝经后骨质疏松症的作用。