基于Illunima Miseq测序技术的黄酒麦曲真菌多样性分析

席啦，孔祥聪，杨少勇，刘忠军，郭壮，赵慧君*

（1.湖北文理学院湖北省食品配料工程技术研究中心，湖北 襄阳 441053；2.襄阳市酿酒生物技术与应用企校联合创新中心，湖北 襄阳 441053；3.湖北古襄阳酒业有限公司，湖北 襄阳 441100）

黄酒是中国的一种传统发酵酒精饮料，已有数千年的历史[1]。与日本酒曲相似，麦曲是黄酒酿造过程中最重要的原料之一，其首先将小麦研磨成粉并添加适量的水制成不同大小的砖块，随后在室温（28℃～30℃）下培养48 h，最后于45℃干燥直至水分含量低于12%（质量比）[2]。在麦曲的制作过程中，会混入各种微生物，包括霉菌和酵母菌等[3]，同时麦曲在发酵过程中，由于微生物的生长代谢，产生了不同含量的高级醇、脂肪酸、醛、酯、酚和酮等化合物[4]，这些都极大地影响了黄酒的风味。为进一步了解黄酒风味的形成因素，有必要对麦曲中的微生物群落结构进行解析。

与传统微生物学手段相比，分子生物学技术可以更好地解析微生物的组成和多样性，并为环境微生物的研究提供新的视角[5]。近年来，随着测序技术的迅速发展和测序成本的快速下降，以Illumina Miseq为代表的第二代测序技术在解析环境微生物多样性中发挥着重要的作用，其具有检测快速、通量高和灵敏度高等优点[6]，不仅广泛应用于土壤检测[7]、肠道微生物菌群解析[8]和水质分析[9]等，在解析传统发酵食品中微生物结构等方面亦有较多的应用，如酸菜[10]、酸奶[11]、米酒[12]、香肠[13]和豆豉[14]等。

本研究利用Illumina Miseq测序技术对黄酒麦曲中真菌的群落结构进行了分析，同时结合多元统计学手段对真菌多样性进行了进一步的解析，以获得麦曲真菌的群落特征，以期为后期黄酒的发酵以及黄酒的风味改良提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

熟麦曲：采集自浙江省丽水市，编号分别为MQ1、MQ2、MQ3 和 MQ4。

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit试剂盒：德国QIAGEN 公司；2×PCR mix、rTaq、dNTP mix 和 DL2000 DNA Marker：宝日医生物技术（北京）有限公司；引物SSU0817F、SSU1196R：武汉天一辉远生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

VeritiTM96孔Thermal cycler PCR仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；NanoDrop 2000/2000c：美国Thermo Fisher公司；DYY-12电泳仪：北京六一仪器厂；FC2化学发光凝胶成像系统：美国ProteinSimple公司；Illunima Miseq PE300高通量测序平台：美国Illumina公司；R920机架式服务器：美国DELL公司；HR40-IIB2生物安全柜：海尔集团电子商务有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品宏基因组提取与检测

依照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit试剂盒所提供的方法对麦曲样品中微生物宏基因组DNA进行提取，使用1.2%的琼脂糖凝胶电泳对其完整度进行检测，使用NanoDrop对其浓度进行评估，并将检验合格的DNA置于-40℃中保存备用。

1.3.2 麦曲真菌18S rRNA聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增及 Illunima Miseq 高通量测序

参考王丹丹等[15]的方法进行麦曲样品真菌18SrRNA PCR扩增及Illunima Miseq高通量测序。其中PCR扩增体系为20 μL的体积，分别为5×PCR缓冲液4 μL，dNTP mix 2 μL，正向引物 SSU0817F（5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3'，加入7个核苷酸通用标签）和反向引物SSU1196R（5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3'）各0.8μL，rTaq酶0.4μL，DNA模板10ng，ddH2O 补至 20 μL。PCR 扩增程序：95℃ 3 min，95℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共 30 次循环，72 ℃ 10 min。用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，检测合格后将PCR产物稀释在同一浓度（100 nmol/L）进行Illunima Miseq高通量测序。

1.3.3 生物信息学分析

参照王玉荣等[16]的质控条件对高通量下机数据进行质量控制和拼接。参照郭壮等[17]的分析方法，基于QIIME分析平台对麦曲样品中的真菌构成和多样性进行了分析。具体分析流程如下：1）使用PyNAST软件对序列进行校准和排齐；2）分别在100%和97%相似性下进行序列归并构建分类操作单元（operational taxonomic unit，OTU）；3）使用 ChimeraSlayer软件识别并删除含有嵌合体的OTU序列；4）基于UNITE数据库进行代表性序列的同源性比对；5）分别对麦曲样本中真菌微生物的α和β多样性进行解析。

1.4 数据处理

基于Office 2019软件对各项数据进行整理和分析；通过Origin 8.5软件进行柱状图的绘制；通过Bio Edit软件和MEGA 7.0软件绘制核心OTU的系统发育树；通过Matlab 2010b软件进行热图的可视化；基于在线 网 站（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）绘制 Venn 图。

2 结果与讨论

2.1 序列多样性与丰富度

本研究采用Illumina Miseq高通量测序技术对采集的4个黄酒麦曲样品中真菌多样性进行解析，18S rRNA测序结果及各分类学地位数量信息如表1所示。

表1 黄酒麦曲样品多样性指数Table 1 The diversity indexs of wheat Qu for yellow wine

由表1可知，本研究4个黄酒麦曲样品共产生138 769条高质量的18S rRNA序列，平均每个样品34 692条序列。首先采用100%相似度对序列进行划分，共获得40 135条无重复序列集，在采用97%相似度建立操作分类单元，共获得4 558个OTU，平均每个样品可获得1 140个OTU。MQ2样品的Chao 1指数、Shannon指数和Simpson指数均具有最大值，分别为5 100、4.19和0.733。由此可见，MQ2麦曲样品中真菌微生物的丰富度和多样性均高于其它麦曲样品。

2.2 基于不同分类地位麦曲中核心真菌菌群分析

纳入本试验的4个黄酒麦曲样品产生的高质量18S rRNA序列中，仅有1.23%和10.72%的序列不能鉴定到门和属水平。分析发现，麦曲样品中的主要真菌门为子囊菌门（Ascomycota）、毛霉亚门（Mucoromycotina）和担子菌亚门（Basidiomycota），其相对平均含量分别为90.21%、8.18%和0.38%。其中优势真菌门（平均相对含量大于1%）为子囊菌门（Ascomycota），但其在每个样品中的相对含量存在明显的差异，其在MQ2样品中的相对含量最高，在MQ4样品中的相对含量最低，分别为97.97%和77.76%。进一步对麦曲样本中优势真菌属（平均相对含量大于1%）的相对含量进行了分析，结果如图1所示。

图1 优势真菌属相对含量的比较分析Fig.1 Comparative analysis of average relative abundance of dominant fungal genera

由图1可知，麦曲样本中的优势真菌属有6个，分别为曲霉属（Aspergillus）、酵母属（Saccharomyces）、横梗霉属（Lichtheimia）、根霉属（Rhizopus）、犁头霉属（Absidia）和脉孢菌属（Neurospora），其相对平均含量分别为68.21%、5.06%、4.35%、3.94%、2.29%和2.08%。酵母属和根霉属在MQ2样品中相对含量最高，分别为19.89%和5.56%，曲霉属和脉孢菌属在MQ3样品中的相对含量最高，分别为70.92%和6.48%，横梗霉属和犁头霉属在MQ1样品中的相对含量最高，分别为14.67%和8.24%。

于丽娟等[18]采用传统分离培养和高通量测序技术相结合的方法对南通白蒲黄酒麦曲中真菌群落结构进行了解析，结果发现主要真菌为隶属于曲霉属的白曲霉（Aspergillus candidus）和米曲霉（Aspergillus oryzae），隶属于枝孢属（Cladosporium）的芽枝状枝孢霉（Cladosporium cladosporioides），隶属于青霉属（Penicillium）的粒状青霉（Penicillium granulatum）和产黄青霉（Penicillium chrysogenum），但该报道与本研究的结论存在明显差异。谭婷婷等[19]发现在北方黄酒麦曲中存在大量的霉菌和酵母菌，其分别为隶属于曲霉属的米曲霉和杂色曲霉（Aspergillus versicolor），隶属于横梗霉属的多枝横梗霉（Lichtheimia ramosa），以及隶属于酵母属的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。任清等[20]利用梯度稀释法和划线纯化法对北宗黄酒麦曲中的微生物进行了分离纯化，共得到了5株真菌，其分别为隶属于根菌属的Talaromyces radicus，隶属于曲霉属的米曲霉和黑曲霉（Aspergillus niger），隶属于脉孢菌属的粗糙脉孢菌（Neurospora crassa），以及隶属于犁头霉属的伞状犁头霉（Absidia corymbifera）。上述结论与本试验结论基本一致，由此可见，尽管麦曲的制作工艺和制作环境会对麦曲中优势微生物的种类和相对含量造成影响，但麦曲中依旧存在大量相同的微生物群落。

2.3 基于OTU水平麦曲中核心真菌菌群分析

本研究进一步在OTU水平上对麦曲中真菌微生物类群进行了揭示，若某个OTU仅在一个样品中出现，则将其定义为该样本中的特有OTU，若在全部麦曲样品中出现则将其定义为核心OTU。对每个样品中的OTU数量进行分析的结果如图2所示。

图2 基于OTU水平的Venn图Fig.2 Venn diagram based on OTU level

由图2可知，本研究共划分了4 558个OTU，其中仅出现1次的OTU个数为3 477个，占OTU总数的76.28%，但其包含的序列仅占总序列数的3.21%；在2个或3个样本中出现的OTU个数分别为403个或303个，分别占OTU总数的8.84%和6.65%，其包含的序列分别占总序列的1.96%和5.14%。虽然麦曲中含有种类繁多的特有微生物类群，但其含量较低，麦曲样品中存在大量的核心真菌类群。

本研究选取包含序列数平均相对含量大于0.5%的OTU绘制热图，结果如图3所示。

图3 平均相对含量大于0.5%核心OTU比较分析Fig.3 Comparative analysis of core OTUs with average relative abundance greater than 0.5%

由图3可知，本研究甄别到的375个核心OTU中，有12个OTU的平均相对含量大于0.5%，分别为 OTU3213、OTU2068、OTU486、OTU2466、OTU3987、OTU3344、OTU4507、OTU1429、OTU623、OTU3245、OTU3417和OTU474，其平均相对含量分别为64.14%、0.78% 、0.84% 、0.53% 、0.73% 、3.12% 、1.37% 、0.94% 、1.21%、0.50%、1.10%和 0.79%。由图4亦可知，OTU3417和OTU474被鉴定为脉孢霉属，OTU623和OTU3245被鉴定为根霉属，OTU4507和OTU1429被鉴定为犁头霉属，OTU3987和OTU3344被鉴定为酵母属，以及 OTU3213、OTU2068、OTU486和 OTU2466 被鉴定为曲霉属。上述结果进一步证实了4个麦曲样本中共有大量的核心真菌类群，12个核心OTU的累计平均相对含量即高达76.05%，且曲霉属为麦曲中的优势真菌。值得注意的是，核心OTU在不同麦曲中的相对含量亦存在一定的差异，这可能与麦曲样品的制作环境和工艺密切相关。

图4 核心OTU相关性分析Fig.4 The correlation analysis of core OTUs

本研究对上述核心OTU之间的相关性关系进行了探究，其结果如图4所示。

由图4可知，OTU3213 与 OTU2068、OTU486、OTU3987和OTU3344均呈显著负相关（P＜0.05）。OTU2068与OTU486、OTU3987和OTU3344均呈极显著正相关（P＜0.001），而与OTU2466呈现出显著正相关（P＜0.05）。OTU486与OTU3987和OTU3344均呈极显著正相关（P＜0.001），而与OTU2466呈现出显著正相关（P＜0.05）。OTU2466（隶属于曲霉属）与OTU3987和OTU3344呈现出显著正相关（P＜0.05），OTU3987与 OTU3344呈现出极显著正相关（P＜0.001）。OTU4507与OTU1429呈现出极显著正相关（P＜0.001），而与OTU3245呈现出非常显著正相关（P＜0.01）。OTU1429与OTU3245呈现出非常显著正相关（P＜0.001），OTU3417和OTU474呈现出极显著正相关（P＜0.001）。由此可见，麦曲中的核心菌群之间存在着显著的相关关系，这可能对维持麦曲中真菌菌群的稳定性具有重要的作用。

3 结论

本研究采用Illumina Miseq测序技术对黄酒麦曲样品中的真菌微生物多样性进行了分析。结果发现，优势真菌门为子囊菌门（Ascomycota）、毛霉亚门（Mucoromycotina）和担子菌亚门（Basidiomycota），优势真菌属为曲霉属（Aspergillus）、酵母属（Saccharomyces）、横梗霉属（Lichtheimia）、根霉属（Rhizopus）、犁头霉属（Absidia）和脉孢菌属（Neurospora）。虽然黄酒麦曲样品中含有少量的特有微生物类群，但样品中依旧存在大量的核心真菌类群。