卵巢癌SOX4介导TGF-β1诱导的上皮间质转化对侵袭转移能力的影响

刘 群 李丽娜 刘 健苗劲蔚

(1.首都医科大学附属北京安贞医院妇产科，北京 100029；2.首都医科大学附属北京妇产医院/北京妇幼保健院妇瘤科，北京 100006；3.首都医科大学附属北京朝阳医院医学研究中心，北京 100020)

卵巢癌(ovarian cancer，OC)是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，虽然其发生率处于妇科肿瘤的第3位，但是其病死率却一直高居首位[1-2]。由于卵巢癌极易发生侵袭转移，所以大部分卵巢癌患者确诊时已处于晚期。虽然随着现代医学技术的发展，卵巢癌的诊断和治疗取得了一定的进步，但是卵巢癌的预后仍不乐观，晚期卵巢癌患者的5年生存率只有26%[1]。筛选新的介导卵巢癌侵袭转移的关键分子，对于研发卵巢癌治疗新策略具有非常重要的意义。

SOX4(SRY-related HMG-box4)是SOX转录因子家族的重要成员，与胚胎发育、肿瘤干性维持、肿瘤增殖、转移和进展密切相关[3-5]。研究[6-10]表明，SOX4在多种癌症中表达上调，包括黑色素瘤[6]、前列腺癌[7]、胃癌[8]、乳腺癌[9]、肝癌[10]等。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是驱动癌症转移的一个重要机制[11]。已有研究[12]表明，SOX4在肾癌EMT过程中起到至关重要的作用。然而，关于SOX4在卵巢癌中的功能和机制目前尚不清楚。转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)通路是激活肿瘤EMT的一条关键通路[13]。本研究探讨了SOX4在卵巢癌中的表达、调控及其对TGF-β1诱导EMT能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

DMEM高糖培养基购自美国Sigma公司；胎牛血清购自澳大利亚Ausbian公司；嘌呤霉素购自美国Gibco公司；LentiCRISPR v2来自张锋实验室，质粒pMD2.G和psPAX2购自美国Addgene公司；Matrigel胶购自美国BD公司；RNA提取试剂Trizol和LipofectamineTM3000试剂购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒购自北京全式金公司；qRT-PCR试剂盒购自日本Takara公司；质粒大提取试剂盒购自德国Qiagen公司；人重组TGF-β1购自美国Protech公司；所有引物合成和菌液测序均由上海生工生物有限公司完成；Western blotting所需的RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和5×蛋白上样缓冲液均购自上海碧云天生物技术有限公司；二喹啉甲酸 (bicinchoninic acid，BCA)试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)化学发光底物购自美国Millipore Corp公司；SOX4抗体购自美国Abcam公司，ZO1、Vimentin、Slug及GAPDH抗体均购自美国CST公司，磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或抗鼠IgG二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 细胞培养

人卵巢癌细胞SKOV3购自美国ATCC细胞库，使用DMEM高糖培养基[含有10%(体积分数)胎牛血清]，于37 ℃和5%(体积分数) CO2的培养箱中培养。TGF-β1溶于10 mmol/L柠檬酸中，用DMEM完全培养基稀释至10 ng/mL加入到细胞中，在培养箱中继续培养，进行后续实验。

1.3 细胞转染

分别将对照Scramle-shRNA-mCherry (NC组)和shSOX4-mCherry敲除质粒(shSOX4组)按照LipofectamineTM3000转染试剂说明书转染进SKOV3细胞，在37 ℃培养箱中培养72 h后收集细胞提取蛋白质和RNA。SOX4的打靶序列为：AGCGACAAGATCCCTTTCATT。

1.4 Transwell实验

取对数生长期细胞1×105个/孔，将200 μL无血清的NC组和shSOX4组细胞悬液分别接种到Transwell小室内，下室加入含有10%(体积分数)胎牛血清的完全培养基，摇匀后放入孵箱内培养24 h；取出小室，吸尽残余培养基，用PBS清洗小室3次，再用4%(质量分数)多聚甲醛固定细胞20 min，1%(质量分数)结晶紫染色20 min，PBS清洗后，用棉签轻轻拭去上室未迁移的细胞，置于显微镜下观察拍照，在10倍视野下，随机选取4个视野计数。侵袭实验需预先向小室内铺一层Matrigel胶(1∶8稀释)，其余步骤与迁移实验一致。

1.5 Western blotting检测蛋白表达

待细胞状态最佳且达到80%～90%，弃去培养基，用预冷PBS洗涤2次，用RIPA裂解液(1 mL RIPA+10 μL PMSF+10 μL蛋白酶抑制剂)提取细胞总蛋白，用试剂盒测定其浓度，95 ℃煮10 min使其变性。取60 μg总蛋白在10% (质量分数)SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，用0.2 μm的PVDF膜进行转膜，在8% (质量分数)脱脂牛奶中封闭1 h后，用含有吐温20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris buffered saline with Tween 20，TBST)洗膜3次后，4 ℃摇床孵育一抗过夜。次日，用TBST洗膜3次/5 min，再用相应的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，最后在Bio-Rad凝胶成像系统进行显影并分析结果。

1.6 RNA提取及qRT-PCR检测SOX4及EMT相关信号分子的表达

用Trizol提取细胞总RNA，使用全式金反转录试剂盒，取1 μg总RNA反转录成cDNA。反转录体系为20 μL，反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，-20 ℃保存。所需引物由上海生工公司设计合成，引物序列见表1，GAPDH为内参。按照qRT-PCR说明书进行反应，体系为20 μL，反应条件为95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环，用2-ΔΔCt法计算基因相对表达水平。所有反应设置3个复孔，以上所有实验均重复3次。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 SOX4在卵巢癌中表达上调

三个卵巢癌样本-TCGA (OV)、Bonome(GSE26712)和Hendrix (GSE6008)数据分析结果均表明SOX在卵巢癌中显著表达上调 (P<0.000 1,P<0.000 1,P=0.006, 图1A )。利用TCGA OV数据库进一步分析发现，SOX4与EMT激活标志物(FN1、VIM、CTNNB1、SNAI1、SNAI2及ZEB1)呈显著正相关(图1B)。

图1 SOX4在卵巢癌中的表达情况及其与EMT标志物相关性分析Fig.1 Expression of SOX4 in ovarian cancer databases and its correlation with EMT markers

2.2 SOX4敲除抑制卵巢癌细胞的EMT

利用RT-PCR和Western blotting技术检测卵巢癌细胞SKOV3中SOX4的敲降效果，结果显示，与对照组(NC)相比，敲降组(shSOX4)细胞中SOX4的mRNA和蛋白水平均显著下降(图2A、2B)。

利用Western blotting和RT-PCR检测对EMT标志物的影响，结果显示SOX4敲降显著上调了上皮标志物ZO1的表达，而显著降低了间质标志物Vimentin和Slug的表达(图2C、2D)。

图2 SOX4敲降对卵巢癌EMT的影响Fig.2 Effect of SOX4 knockdown on EMT of ovarian cancer

2.3 SOX4敲除抑制卵巢癌细胞的侵袭转移能力

Transwell实验表明，与对照细胞相比，SOX4敲降显著下调了卵巢癌细胞的迁移能力(P<0.01, 图3A)和侵袭能力(P<0.01，图3B)。

图3 SOX4敲降对卵巢癌SKOV3细胞迁移和侵袭能力的影响Fig.3 Effect of SOX4 knockdown on migration and invasion of SKOV3 cells

2.4 SOX4是TGF-β1的下游靶蛋白

TCGA数据分析卵巢癌中SOX4与TGFB1基因的mRNA表达水平显著正相关(r=0.22，P=3×10-6，图4A)。利用TGF-β1(10 ng/mL)处理卵巢癌SKOV3细胞，Western blotting和RT-PCR检测结果显示，TGF-β1处理后SOX4的mRNA水平(图4B)和蛋白水平(图4C)均显著上调。

图4 SOX4是TGF-β1的下游靶蛋白Fig.4 SOX4 is a downstream target of TGF-β1

2.5 SOX4介导TGF-β1对卵巢癌EMT的激活作用

利用TGF-β1处理对照和SOX4敲降细胞系，Western blotting检测结果显示，对照细胞中TGF-β1处理可以显著下调上皮标志物ZO-1的表达，并上调间质标志物Vimentin和Slug的表达。然而，对于SOX4敲降细胞，TGF-β1处理后，上皮标志物ZO-1下调受到明显抑制，并且间质标志物Vimentin和Slug也失去了上调的能力(图5A)。该结果在mRNA水平通过RT-PCR技术得到了进一步验证(图5B)。

3 讨论

肿瘤转移是导致卵巢癌患者死亡的最主要原因，严重威胁全球女性生命健康[13]。近年来，针对SOX4在肿瘤中的功能与机制研究引起了广泛关注。目前，在黑色素瘤、前列腺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤中均发现了SOX4的异常表达[6-10]，广泛促进相关肿瘤的增殖、转移与干细胞维持[3-5]。然而，关于SOX4在卵巢癌中的功能与机制尚无深入研究。

图5 SOX4敲降对TGF-β1诱导卵巢癌EMT能力的影响Fig.5 Effect of SOX4 knockdown on TGF-β1-induced EMT in ovarian cancer

本研究通过检测SOX4在多个卵巢癌样本中的表达情况，发现SOX4在浆液性及黏液性卵巢癌中均有广泛上调，且与卵巢癌间质标志物呈显著正相关，提示SOX4具有调控卵巢癌EMT的潜能，该推测在卵巢癌SKOV3细胞中，通过shRNA介导的基因敲降技术得到了证实。SOX4敲降后，卵巢癌细胞上皮细胞标志物ZO-1显著升高，而间质标志物Vimentin和Slug显著下降。SOX4促进EMT的分子功能在肾癌和乳腺癌等多种肿瘤中也得到了证实[9,12]。

在癌症发生发展过程中，TGF-β扮演了双重角色。在癌症发生的早期阶段，TGF-β被认为是有效的肿瘤抑制因子，然而在癌症发生晚期，TGF-β发挥了明显的促转移作用[14]。肿瘤组织中的TGF-β来源于癌细胞和肿瘤微环境中包括Treg在内的多种细胞类型，另外，成纤维细胞、巨噬细胞和血小板等也是肿瘤中TGF-β的重要产生者[14]，而TGF-β作用于肿瘤细胞可显著激活其EMT并导致侵袭转移的发生[15]。TCGA数据分析表明，卵巢癌中SOX4的表达水平与TGF-β1显著正相关，提示SOX4在卵巢癌中的表达可能受TGF-β1调控。通过体外实验，笔者充分证实SOX4是TGF-β1的下游靶蛋白，表明TGF-β1可能是卵巢癌中SOX4表达上调的一个重要因素。功能分析显示，SOX4缺失可显著抑制TGF-β1诱导卵巢癌EMT的能力，表明SOX4是TGF-β1诱导卵巢癌EMT的一个关键中间因子。而SOX4受TGF-β1的表达调控，以及SOX4在介导TGF-β1诱导肿瘤EMT中的关键作用，在乳腺癌[16]和胃癌[17]中也同样得到了证实，进一步表明SOX4是TGF-β1通路促进肿瘤转移的一个关键分子。

综上，本研究充分揭示SOX4作为TGF-β1的下游靶蛋白，在卵巢癌中表达上调，并且介导了TGF-β1对卵巢癌EMT的诱导过程，表明SOX4有可能成为干预卵巢癌转移的一个新的治疗靶点。