miR-671-3p靶向调控CKAP4对人脑胶质瘤细胞增殖及迁移的影响

莫家鹏， 刘群会， 章慧， 向春晖

(1.恩施土家族苗族自治州中心医院神经内科，湖北省恩施市445000；2.上海建工医院神经内科，上海市200083；3.恩施土家族苗族自治州中心医院神经外科，湖北省恩施市445000)

脑胶质瘤是一种发生于中枢神经系统的常见恶性肿瘤，患者预后较差[1]。细胞骨架相关蛋白4(cytoskeleton associated protein 4, CKAP4)是人类癌抗原组成成分之一，能够介导癌症发生相关信号通路[2-3]。有研究显示，CKAP4在人脑胶质瘤组织标本中显著降低[4]，但关于CKAP4与脑胶质瘤发生发展关系的报道较少。近年随着对微小RNA(microRNA, miRNA)研究的深入，认为miRNA表达与神经胶质母细胞瘤的发展相关，可能成为潜在的肿瘤分子标志物及治疗靶点[5]。因此，本文对miR-671-3p是否可靶向调控CKAP4进行了研究，以期为脑胶质瘤的分子治疗提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2018年3月—2020年3月本院病理科术后脑胶质瘤组织及配对癌旁5 cm正常组织标本8对，均符合脑胶质瘤病理学诊断且术前无药物、化学治疗史；术中液氮冷冻后放入-80 ℃保存，研究方案通过本院伦理委员会批准。脑胶质瘤U251细胞由武汉普诺赛生命科技有限公司提供。DMEM培养基含10%胎牛血清(fulfillment by store,FBS)。miR-671-3p 阴性对照(miR-671-3p NC)、miR-671-3p模拟物(miR-671-3p mimic)、miR-671-3p抑制剂(miR-671-3p inhibitor)均购自上海吉凯生物公司。快速定点诱变试剂盒购自Agilent Technologies公司；pGL4荧光素酶载体和双荧光素酶报告基因检测系统购自美国Promega公司。

1.2 细胞分组与转染

将细胞接种于6孔细胞培养板中(5×104个/孔)进行传代培养。将细胞分为miR-671-3p NC组、miR-671-3p mimic组、miR-671-3p inhibitor组，分别转染miR-671-3p NC、miR-671-3p mimic和miR-671-3p inhibitor质粒。根据LipofectAMINE 2000转染试剂盒使用说明书对U251细胞进行转染，转染结束后更换新的培养基并开展后续研究。

1.3 聚合酶链反应检测miR-671-3p mRNA表达

试剂盒提取标本组织中总RNA并检测其纯度，TaKaRa反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，以此cDNA为模板参照引物和探针序列进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增。扩增体系为cDNA模板1 μL，上下游miR-671-3p引物各0.5 μL，SYBR Premix ExTaq 10 μL，加无核酶水补充至20 μL。反应条件：95 ℃预变性15 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，45次循环。根据扩增曲线读取循环数(Ct)，以2ΔΔCt计算miR-671-3p mRNA含量。

1.4 CCK测定细胞增殖能力

接种细胞于培养板中，每孔加入10 μL CCK-8溶液后培养，3 h后采用酶标仪测定第1、2、3、4、5、6天时450 nm波长处光密度(OD)，细胞增殖率(%)=(实验组OD/空白组OD)×100%。

1.5 细胞迁移能力的测定

细胞调整至2×108个/L，500 μL完全培养液加至Transwell小室下室，200 μL无血清培养液加至上室内，37 ℃孵育24 h，4%多聚甲醛固定，PBS清洗， DAPI染色，制备玻片，封片，于荧光显微镜下观察细胞迁移情况。

1.6 荧光素酶报告基因分析

miR-671-3p和CKAP4的结合位点通过工具网站Targetscan得到(http://www.targetscan.org/vert_72/)。对于miR-671-3p和CKAP4靶向的验证，将野生型WT-CKAP4 mRNA的3′-非翻译区(UTR)序列扩增到pGL4荧光素酶载体的下游位点，并使用快速定点诱变试剂盒生成突变型MUT-CKAP4。使用Lipo2000将pGL4-WT-CKAP4/pGL4-MUT-CKAP4和miR-671-3p mimics或miR-671-3p NC共转染到细胞中。转染36 h后，使用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。

1.7 Western blotting法检测细胞中CKAP4表达水平

细胞中加入200～300 μL 85 ℃RIPA蛋白裂解细胞；裂解样品经煮沸、超声、离心后，取上清液，紫外光谱检测定量，-20 ℃分装保存；将50 μg样品加入1×SDS凝胶加样缓冲液，100 ℃变性10 min，顺序加样，行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳；经湿式电转仪恒流冰浴转膜，5%脱脂牛奶4 ℃封闭1 h；分别孵育CKAP4 16686-1-AP 一抗后，在4 ℃过夜；加入羊抗兔/抗鼠二抗孵育1 h，化学发光、显影、定影，观察杂交信号；重复3次，Image J软件比较各组细胞和组织中CKAP4与β-actin灰度值比值。

1.8 统计学方法

使用SPSS23.0软件进行统计分析，针对不同样本及不同比较模式选择F检验、SNK-q检验、配对t检验等；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 人脑胶质瘤组织中miR-671-3p、CKAP4 mRNA的表达水平

人脑胶质瘤组织中miR-671-3p mRNA表达量显著高于癌旁正常组织，CKAP4 mRNA表达量显著低于癌旁正常组织(P<0.05；图1)。

图1 人脑胶质瘤组织中miR-671-3p、CKAP4 mRNA的表达水平a为P<0.05，与癌旁正常组织比较。

2.2 miR-671-3p对U251细胞增殖的影响

自第4天起，与miR-671-3p NC组比较，miR-671-3p mimic组细胞增殖率升高，miR-671-3p inhibitor组增殖率降低；3组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05；图2)。

图2 miR-671-3p对U251细胞增殖的影响a为P<0.05，第4、5、6天3组间两两比较。

2.3 miR-671-3p对U251细胞迁移的影响

与miR-671-3p NC组比较，48 h后miR-671-3p mimic组细胞穿过小室膜细胞数显著增加，而miR-671-3p inhibitor组穿过小室膜细胞数最少，3组细胞迁移率两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05，图3)。

图3 miR-671-3p对U251细胞迁移率的影响(200×)1为miR-671-3p NC组；2为miR-671-3p mimic组；3为miR-671-3p inhibitor组。a为P<0.05，与miR-671-3p NC组比较；b为P<0.05，与miR-671-3p mimic组比较。

2.4 miR-671-3p对CKAP4具有靶向调节作用

为预测miR-671-3p的潜在靶点，本研究通过生物信息学网站(www.Targetscan.org)寻找miR-671-3p的潜在作用靶点，发现miR-671-3p与CKAP4有潜在的结合位点(图4A)。为了检测CKAP4是否被miR-671-3p直接抑制，通过荧光素酶报告基因实验发现，在WT-CKAP4与miR-20a mimic共转染后，荧光素酶报告基因活性明显下降(P<0.05；图4B)，说明miR-671-3p能够直接抑制CKAP4表达。

图4 生物信息学软件预测CKAP4为miR-671-3p的靶基因A为生物信息学软件预测miR-671-3p与CKAP4 3′-UTR结合位点；B为双荧光素酶活性测定。a为P<0.05，与miR-671-3p NC组比较。

2.5 miR-671-3p对CKAP4的调控作用

与miR-671-3p NC组比较，miR-671-3p mimic组CKAP4蛋白表达显著减弱；miR-671-3p inhibitor组CKAP4蛋白表达较miR-671-3p mimic组增强(P<0.05；图5)。

图5 miR-671-3p对CKAP4蛋白表达的调控作用1为miR-671-3p NC组；2为miR-671-3p mimic组；3为miR-671-3p inhibitor组。a为P<0.05，与miR-671-3p NC组比较；b为P<0.05，与miR-671-3p mimic组比较。

3 讨 论

脑胶质瘤是由遗传高危因素和环境致癌因素相互作用导致大脑胶质细胞癌变所产生，作用机制较复杂且尚存在争议[6]。现阶段脑胶质瘤以手术治疗为主，辅以放化疗，但因脑胶质瘤细胞增殖迅速、恶性程度高，患者往往预后不良。有研究认为脑胶质瘤本质上是一种多基因异常的疾病，由于原癌基因过表达，使肿瘤细胞异常增殖[7]。越来越多的研究发现miRNA参与了肿瘤发生发展，小分子miRNA不仅能够轻松从细胞中分泌出来，在治疗上使用也非常方便[8]，因此本研究从分子基因角度探讨脑胶质瘤发病机制，以期为脑胶质瘤的基因靶向治疗提供新的方向。

miR-671可分为miR-671-3p和miR-671-5p，miR-671-5p具有抑制肿瘤生长的作用。本研究结果显示，miR-671-3p在脑胶质瘤细胞中呈高表达，miR-671-3p模拟物可显著提高胶质瘤细胞增殖和迁移能力，而通过miR-671-3p抑制剂处理后细胞增殖和迁移能力受到显著抑制，提示高表达的miR-671-3p促进了脑胶质瘤细胞增殖、迁移能力。

CKAP4属于跨膜蛋白转录因子家族成员，可参与调节细胞增殖、分化及有丝分裂过程，是食管癌、肝细胞肝癌、口腔鳞状细胞癌、胃癌肿瘤疾病发生、进展的重要机制[9-10]。人CKAP4蛋白可特异性介导多种分泌性蛋白，影响Wnt通路以发挥拮抗抗癌作用。Zhao等[11]对CKAP4基因敲除鼠研究发现，CKAP4低表达可显著抑制腹主动脉瘤增殖。本研究发现，CKAP4在脑胶质瘤细胞中低表达，说明CKAP4具有抑制癌症进展的作用。miR-671-3p在脑胶质瘤中作用机制的相关报道较少，为明确其潜在的作用靶点，本研究对miR-671-3p的潜在靶点进行预测，发现miR-671-3p与CKAP4 3′-UTR存在互补结合位点，确定CKAP4是miR-671-3p的潜在功能靶点。荧光素酶实验结果显示，当 CKAP4 3′-UTR存在时，转染miR-671-3p模拟物导致荧光素酶活性显著降低；而当报告质粒在含有突变体CKAP4 3′-UTR的载体中时，荧光素酶活性无该变化。上述结果表明，CKAP4 3′-UTR特定区域内的序列确实存在相互作用使miR-671-3p直接靶向CKAP4。为了进一步研究miR-671-3p是否调节CKAP4的表达，本研究分析miR-671-3p表达对U252细胞CKAP4蛋白水平的影响，结果发现，过表达的miR-671-3p可显著降低CKAP4表达水平，而miR-671-3p抑制物可逆转miR-671-3p过表达对CKAP4的抑制作用。本研究结果证实了miR-671-3p可靶向作用于CKAP4而促进脑胶质瘤细胞增殖，miR-671-3p对CKAP4的负调控可能与miR-671-3p在胶质瘤进展中的功能作用有关。目前研究发现，NF-κB诱导miR-671-5P维持神经胶质母细胞瘤中TGF-β/Smad信号通路的活化[12]；miR-671-3p在IDH1 R132H突变的人脑胶质瘤中通过下调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)来促进胶质瘤其迁移和侵袭[13]；胶质瘤细胞外泌体通过分泌miR-671-3p靶向激活多种生长因子和细胞凋亡调节因子的表达，促进胶质母细胞瘤细胞增殖和转移[14]。本研究结合既往文献分析可能机制为miR-671-3p高表达时，胶质瘤细胞VEGF表达受到抑制，进而影响血管形成和脑胶质瘤细胞增殖[15]。由此提示，miR-671-3p高表达可促进脑胶质瘤U251细胞增殖及侵袭，且miR-671-3p可能是人脑胶质瘤治疗的重要潜在靶标。

综上所述，miR-671-3p在脑胶质瘤细胞中高表达，CKAP4在人脑胶质瘤细胞中低表达，二者呈负相关；miR-671-3p对细胞增殖具有促进作用，CKAP4为miR-671-3p的潜在功能靶点，miR-671-3p可靶向抑制CKAP4表达发挥促癌作用，miR-671-3p抑制剂可逆转miR-671-3p对脑胶质瘤细胞增殖的促进作用，可能成为脑胶质瘤疾病中治疗的新靶点。但由于时间限制、样本量小，仅以单一miRNA作为脑胶质瘤进展的预测因子，CKAP4蛋白可能也会受其他miRNA的影响，仍需设计更为严密、多中心、大样本、双盲的研究进一步分析。