结直肠癌离心性表达Cdc42伴E-cadherin缺失的预后分析

罗金风，刘广龙，徐东艳，李小清，邓永键

细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42, Cdc42)是小GTP酶Rho家族成员，在响应不同信号时可以从无活性GDP结合形式转变为活性GTP结合形式[1]，参与维持细胞骨架、细胞极性、分子运输等[2-4]。Cdc42在多种肿瘤中过度激活，参与肿瘤的发生、发展过程。本课题组前期实验发现，Cdc42在结直肠癌中存在表达分布的差异，有表达朝向腺管中心的向心性表达和表达背离腺管中心的离心性表达，且其离心性表达与细胞侵袭性伪足形成有关[5]，但具体机制尚不清楚。E-cadherin分子参与维持细胞极性[6]，与肿瘤转移行为有关[7]。那么Cdc42离心性表达是否与E-cadherin分子之间存在关系呢？本实验采用免疫组化法检测Cdc42和E-cadherin在结直肠癌组织中的表达分布情况，并分析其表达与临床病理学特征的关系，同时采用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测两者的表达调控关系，为转移性结直肠癌提供新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1临床资料 收集2007年1月～2008年12月南方医科大学南方医院病理科存档的结直肠癌标本198例，均具有完整的随访资料，其中男性106例，女性92例；年龄≤60岁80例，>60岁118例；浸润深度达固有肌层33例，达浆膜下层133例，突破浆膜层32例；无淋巴结转移130例，有淋巴结转移68例；无远处转移180例，有远处转移18例。标本均经两名经验丰富的病理医师明确诊断，且所有患者术前均未接受放、化疗。

1.1.2细胞 结直肠癌细胞HCT116、LS174t、SW480、Caco2、SW620、LoVo，均购自ATCC库。

1.2 方法

1.2.1免疫组化 免疫组化染色采用EnVision两步法，将组织蜡块制作成组织芯片，3 μm厚连续切片，烤干备用。常规脱蜡至水，柠檬酸盐进行高压热修复，3%H2O2封闭，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，DAB显色5 min，苏木精复染，1%盐酸乙醇分化，PBS返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。用PBS代替一抗作为阴性对照。兔多克隆抗体Cdc42(ab187643，稀释比1 ∶200)购自美国Abcam公司，即用型E-cadherin(ZM-0092)抗体、通用型试剂盒(PV 6000)、DAB显色试剂盒(ZLI-9017)，均购自北京中杉金桥公司。

1.2.2免疫荧光 组织切片常规脱蜡至水，抗原修复，滴加一抗孵育过夜，滴加荧光二抗孵育，DAPI(Biosharp)染核，甘油封固。Alexa Fluor 488标记抗兔IgG(购自北京中杉金桥公司)。

1.2.3细胞培养和转染 所有结直肠癌细胞均使用含10%胎牛血清的RPMI-1640，置于37 ℃ 5%CO2孵育箱中进行培养。待细胞生长状态良好，消化铺板，使用Lipofectamine 3000(Invitrogen公司)转染Control和Cdc42质粒，48 h后检测转染效率并开展后续实验。

1.2.4实时荧光定量PCR 采用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测浓度和纯度均合格，逆转录生成cDNA，使用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit(AG11701)进行实时荧光定量PCR检测，引物序列详见表1。采用2-ΔΔCt法计算各组mRNA的相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.2.5Western blot法 待细胞生长状态良好时，铺板转染，48 h后收集细胞，加入细胞裂解液，冰上裂解30 min，离心取上清，BCA法测定蛋白浓度，加入Loading Buffer变性，-20 ℃保存。使用PAGE凝胶快速制备试剂盒(PG112)配制10%凝胶，恒压120 V、90 min电泳，恒流200 mA、90 min转模，5%牛奶室温封闭1 h，一抗Cdc42和E-cadherin 4 ℃摇床孵育过夜，室温孵育二抗45 min，显影并用Image J软件进行灰度分析。

1.3 判断标准Cdc42阳性定位于细胞质，表达朝向腺管中心，位于腺体顶端为向心性表达，表达背离腺管中心，位于腺体基底部为离心性表达。随机选取5个高倍视野，只要观察到一个细胞存在离心性表达，即将此病例判读为离心性表达，否则为向心性表达。Cdc42离心性表达的病例，做连续切片，检测同一位置的E-cadherin表达，E-cadherin表达定位于细胞膜，阴性判读为E-cadherin表达缺失。与离心性表达相比，向心性表达的患者预后较好，因不是本实验的主要研究对象，故在此不进行E-cadherin表达情况的分析。

1.4 统计学分析采用SPSS 23.0软件对各组数据进行统计学分析，χ2检验分析各组间表达的差异性；Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-rank检验比较生存率；两独立样本t检验分析实时荧光定量PCR结果。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织中Cdc42的表达Cdc42表达主要定位于细胞质。Cdc42表达朝向腺管中心，为向心性表达，表达背离腺管中心为离心性表达(图1、2)，本实验中有45.96%(91/198)病例伴Cdc42的离心性表达。统计分析结果显示，Cdc42离心性表达与结直肠癌浸润深度(P=0.011)、淋巴结转移(P<0.001)和远处转移(P<0.001)密切相关，与患者性别、年龄无关(P均>0.05，表2)，且与患者不良预后相关(P<0.001，图3)。

图1 免疫荧光法检测Cdc42在结直肠癌组织中的表达

图2 免疫组化法检测Cdc42在结直肠癌组织中的表达：A.Cdc42呈离心性表达；B.Cdc42呈向心性表达，EnVision两步法

图3 Cdc42不同表达模式与患者预后的关系

表2 Cdc42表达与结直肠癌临床病理特征的关系[n(%)]

2.2 Cdc42离心性表达伴E-cadherin表达缺失Cdc42离心性表达的病例做连续切片，检测同一位置的E-cadherin表达，发现有73.63%(67/91)伴有E-cadherin表达缺失(图4)。统计分析结果显示，伴E-cadherin表达缺失与结直肠癌浸润深度(P=0.006)密切相关，而与患者性别、年龄、淋巴结转移和远处转移无关(P>0.05，表3)，且与患者不良预后相关(P<0.001，图5)。

图4 Cdc42离心性表达伴E-cadherin表达缺失：A.Cdc42离心性表达；B.E-cadherin表达缺失，EnVision两步法

图5 Cdc42离心性表达伴E-cadherin不同表达模式与结直肠癌患者预后的关系

表3 Cdc42离心性表达伴E-cadherin缺失与结直肠癌临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 Cdc42与E-cadherin表达之间的关系实时荧光定量PCR检测结果显示，Cdc42在SW480细胞中呈低表达。选取SW480细胞进行过表达Cdc42处理，验证过表达效率，实时荧光定量PCR和Western blot法检测结果均显示，当Cdc42过表达时E-cadherin表达下调(图6)。

图6 Cdc42与E-cadherin表达之间的关系：A.Cdc42在结直肠癌细胞中的表达；B.过表达Cdc42使E-cadherin的mRNA水平下调；C.过表达Cdc42使E-cadherin的蛋白水平下调

3 讨论

近年结直肠癌的早期诊断和治疗虽取得极大的进展，但肿瘤侵袭、转移仍然是导致结直肠癌患者预后不良的主要原因。肿瘤细胞转移是一个多步骤、多阶段、多分子参与的过程[8]。首先是细胞间黏附能力的丧失，上皮细胞向间充质细胞表型转变，该过程称为上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)[9]。EMT转变过程由多种转录因子和信号通路参与，包括ZEB1、ZEB2、Twist、Snail、Slug等，各种信号通路如TGF-β、Wnt信号通路、PI3K/AKT轴等[10-11]，E-cadherin分子在其中发挥至关重要的作用。E-cadherin由CDH1基因编码，位于染色体16q22.1上，属于Ⅰ型钙黏蛋白，成熟的E-cadherin蛋白是一种Ca2+依赖性跨膜糖蛋白分子，胞外域由5个钙黏蛋白重复序列(EC)组成，与邻近细胞相互作用介导细胞间黏附；胞内域的近膜域(juxtamembrane domain, JMD)与p120结合，防止E-cadherin的泛素化降解，连环蛋白结构域(catenin binding domain, CBD)与β-catenin结合，后者与α-catenin结合，α-catenin与细胞骨架肌动蛋白结合发挥作用[12-14]。E-cadherin主要通过黏附连接将正常和极化的上皮细胞紧密结合在一起，对于维持组织结构的完整性至关重要[15]，E-cadherin表达缺失是EMT发生的重要标志，与多种肿瘤的不良预后相关。

Cdc42参与肿瘤转移的多个过程，如Cdc42参与侵袭性伪足的形成[5]，Cdc42调控肌球蛋白收缩性从而促进肿瘤的侵袭运动能力[16]。由此可见，Cdc42可作为肿瘤转移的关键调节分子。有研究表明，Cdc42的激活会促进E-cadherin蛋白的溶酶体降解，从而有助于间充质表型的发生[17]，也可以通过其效应分子CIP4促进β-catenin蛋白易位到细胞核抑制E-cadherin的表达[18]。Cdc42在结直肠癌中表达分布存在差异，其特异性的离心性表达与结直肠癌的不良预后相关[5]，这种特异性的分布是否也与E-cadherin蛋白之间存在关系，从而促进结直肠癌的进展。

免疫组化结果显示，Cdc42在结直肠癌中的离心性表达与组织浸润、淋巴结转移和远处转移密切相关，且伴有离心性表达的患者预后不良，提示Cdc42的离心性表达可能与结直肠癌的侵袭和转移有关。Cdc42离心性表达的病例中有73.63%伴E-cadherin蛋白的缺失，伴E-cadherin表达缺失与组织浸润密切相关，并且患者预后明显更差，实时荧光定量PCR和Western blot法检测结果均显示，过表达Cdc42后，E-cadherin表达下调，可初步证实两者确实存在调控关系。

综上所述，Cdc42在结直肠癌中离心性表达与肿瘤侵袭和转移相关，预示患者的不良预后，这一过程有E-cadherin分子参与，针对两者的监测和靶向可以为转移性结直肠癌提供新的治疗策略。本文仅初步验证两者存在的关系，实验仍然存在一定的局限性，其具体的调控机制仍需后续实验进一步深入探讨。