龙胆苦苷对过氧化氢诱导的心肌细胞损伤的保护作用及对PI3K/AKT信号通路的影响

解娜 (新乡医学院第三附属医院心内科，河南 新乡 453003)

活性氧(ROS)积累引起的氧化应激损伤是包括缺血/再灌注损伤在内的多种心血管疾病发生发展的重要机制〔1〕。在病理情况下，ROS产生和清除失去平衡，大量的ROS能够攻击DNA、蛋白质和脂质膜，引发脂质过氧化，导致心肌细胞中抗氧化酶的耗竭或失活，继而导致细胞损伤甚至细胞凋亡〔2〕。龙胆苦苷(GPS)为从龙胆科植物中提取的含环烯醚萜苷类主要有效成分，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、镇痛、保肝利胆等多种药理活性〔3〕。此外，GPS还可提高心脏收缩能力和心肌细胞抗凋亡能力，明显减轻缺血再灌注对心脏的损伤〔4,5〕。然而，GPS心肌保护作用机制并不明确。H9C2是从大鼠胚胎期心脏分离的细胞系，具有分裂能力，是研究心血管疾病的理想细胞模型〔6〕。本研究通过探究GPS对过氧化氢(H2O2)诱导的H9C2细胞氧化应激损伤、凋亡的影响，初步探讨其潜在分子机制，以期为GPS抗心肌细胞氧化应激损伤的深入研究及临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1实验材料 大鼠心肌细胞H9C2购于中国科学院典型培养物保藏中心；DMEM培养液、胎牛血清购于美国GIBCO公司；青链霉素双抗溶液及丙二醛(MDA)、乳酸盐脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购于北京索莱宝生物公司；GPS(批号110770-201817，纯度98.2%)购于中国食品药品检定研究院；噻唑蓝(MTT)、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(AnnexinV-FITC)凋亡检测试剂盒购于上海碧云天生物公司；兔源裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3抗体、兔源B淋巴细胞瘤(Bcl)-2抗体，兔源Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体，兔源磷酸化的磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K)抗体，兔源PI3K抗体，兔源磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)抗体，兔源AKT抗体购于美国CST公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养、模型构建和分组 采用DMEM培养液于37℃、CO2体积分数5%细胞培养箱中培养H9C2细胞。培养基中添加10%胎牛血清，1%的青链霉素双抗溶液。采用700 μmol/L的H2O2孵育H9C2细胞24 h复制心肌细胞氧化应激损伤模型〔7〕。为检测GPS对H9C2细胞的毒作用，用含不同浓度(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μmol/L)GPS的培养液孵育H9C2细胞24 h，MTT法检测细胞活力，确定后续试验GPS浓度。实验分为正常对照(NC)组、H2O2组(700 μmol/L H2O2孵育24 h)、H2O2+GPS组(10、20、40 μmol/L的GPS预处理24 h，其余同H2O2组)。

1.2.2MTT法检测细胞活力 取1×104个H9C2细胞接种96孔板，按照实验分组进行细胞处理，随后弃去细胞培养液，每孔加入10 μl的MTT溶液和100 μl的DMEM培养液，培养箱继续孵育4 h，加入100 μl的二甲基亚砜(DMSO)，酶标仪检测570 nm波长处光密度(OD)值，计算细胞存活率。细胞存活率=〔(OD实验孔-OD空白孔)/(OD对照孔-OD空白孔)〕×100%

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡 H9C2细胞按照上述分组干预后，胰酶消化后磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，用适量结合缓冲液调整为单细胞悬液。取100 μl加入流式管，分别加入5 μl Annexin V-FITC、5 μl丙化碘啶(PI)，避光孵育15 min，补加结合缓冲液400 μl。混匀后，上机检测细胞凋亡情况。

1.2.4心肌细胞损伤和氧化应激指标检测 H9C2细胞按照上述分组干预后，吸取细胞培养液，按照ELISA试剂盒说明检测MDA含量及LDH、AST、CK释放量。超声波破碎各组H9C2细胞，收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明检测CAT、SOD和GSH-Px活性及ROS水平。

1.2.5Western印迹检测Cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax和PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平 用预冷的细胞裂解液分别提取H9C2细胞总蛋白。蛋白定量后，取适量蛋白与等体积上样缓冲液混合，煮沸3 min使其变性。取30 μg蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。利用湿法转膜装置将分离的细胞蛋白转移至硝酸纤维素(NC)膜。将NC膜置于5%脱脂牛奶中37℃封闭1 h。洗膜后，将其置于1∶1 000稀释的一抗溶液中37℃孵育2 h。洗膜后，将其置于二抗溶液中37℃孵育1 h。将膜置于化学发光显色液中避光显影。以β-actin为内参，图像处理软件分析目的蛋白相对表达水平。

1.3统计学分析 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1不同浓度龙胆苦苷对心肌细胞存活的影响 用不同浓度的龙胆苦苷干预H9C2细胞24 h，MTT法检测细胞存活率显示，NC组、GPS 2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μmol/L组细胞存活率分别为(101.82±2.68)%、(103.78±1.86)%、(108.46±6.30)%、(105.59±6.81)%、(107.51±0.99)%、(99.10±2.04)%、(93.71±5.45)%、(79.24±2.22)%。当GPS浓度达到20.0 μmol/L时H9C2细胞存活率显著升高，当GPS浓度达到80.0 μmol/L时对H9C2细胞表现出显著的细胞毒作用。选择10.0、20.0、40.0 μmol/L的GPS浓度进行后续实验。

2.2不同浓度龙胆苦苷对H2O2诱导的心肌细胞损伤的影响 与NC组比较，H2O2组H9C2细胞上清液中LDH、AST、CK释放量、MDA含量显著升高；与H2O2组比较，H2O2+GPS 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L组H9C2细胞上清液中LDH、AST、CK释放量、MDA含量显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 不同浓度龙胆苦苷促进H2O2处理对心肌细胞损伤、凋亡及Cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

2.3不同浓度龙胆苦苷对H2O2诱导的心肌细胞凋亡的影响 与NC组比较，H2O2组H9C2细胞凋亡率显著升高；与H2O2组比较，H2O2+GPS 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L组H9C2细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见表1和图1。

2.4不同浓度龙胆苦苷对H2O2诱导的心肌细胞凋亡蛋白表达的影响 与NC组比较，H2O2组H9C2细胞Cleaved caspase-3和Bax蛋白表达显著升高、Bcl-2蛋白表达显著降低；与H2O2组比较，H2O2+GPS 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L组H9C2细胞Cleaved caspase-3和Bax蛋白表达显著降低、Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05)。见表1、图2。

2.5不同浓度的龙胆苦苷对H2O2诱导的心肌细胞活性氧产生的影响 与NC组比较，H2O2组H9C2细胞ROS含量显著升高；与H2O2组比较，H2O2+GPS 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L组H9C2细胞ROS含量显著降低(P<0.05)。见表2。

图1 流式细胞术检测心肌细胞凋亡

2.6不同浓度的龙胆苦苷对过氧化氢诱导的心肌细胞CAT、SOD和GSH-Px活性的影响 与NC组比较，H2O2组H9C2细胞CAT、SOD和GSH-Px活性显著降低；与H2O2组比较，H2O2+GPS 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L组H9C2细胞CAT、SOD和GSH-Px活性显著升高(P<0.05)。见表2。

2.7不同浓度龙胆苦苷对过氧化氢诱导的心肌细胞AKT信号通路的影响 与NC组比较，H2O2组H9C2细胞p-PI3K和p-AKT表达水平显著降低；与H2O2组比较，H2O2+GPS 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L组H9C2细胞p-PI3K和p-AKT表达水平显著升高(P<0.05)。见表2和图3。

表2 不同浓度龙胆苦苷H2O2处理心肌细胞ROS、CAT、SOD、GSH-Px、p-PI3K、PI3K、AKT和p-AKT表达的影响

图3 检测心肌细胞中p-PI3K、PI3K AKT和p-AKT蛋白表达

3 讨 论

GPS作为一种传统中药，在我国已广泛用于治疗类风湿关节炎、胃痛等疼痛和炎症性疾病。研究显示，GPS可能通过抗炎、抗氧化机制对大鼠骨关节炎、乙醇诱导的小鼠胃黏膜损伤具有保护作用〔8,9〕。GPS通过抑制核因子-κB和丝裂原激活的蛋白激酶信号通路减轻星形胶质细胞介导的炎性反应进而预防神经元损伤〔10〕。此外，GPS还可减轻内皮细胞氧化应激损伤和凋亡，发挥内皮细胞保护作用〔11〕。

H2O2是超氧阴离子、羟基自由基等高活性氧自由基的主要前体，可诱导细胞氧化应激损伤和凋亡。MDA是细胞脂质过氧化反应终产物，其含量高低可反映细胞氧化损伤程度〔12〕。正常心肌细胞内存在LDH、AST、CK等多种心肌酶类，其释放量增加提示细胞通透性改变或细胞损伤〔13〕。CAT、SOD和GSH-Px是机体内重要的抗氧化化酶，可抑制自由基产生，平衡机体代谢，然而ROS的大量产生导致CAT、SOD和GSH-Px耗竭，破坏机体氧化和抗氧化动态平衡，诱导氧化应激损伤〔12〕。本研究显示，GPS预处理可显著提高H2O2诱导的H9C2细胞中CAT、SOD和GSH-Px活性，降低细胞ROS水平，抑制MDA产生以及LDH、AST、CK的释放，提示GPS可能通过增强H9C2细胞抗氧化能力减轻H2O2诱导H9C2细胞损伤。

过量的氧化应激可诱导心肌细胞凋亡〔14〕。Cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax细胞是参与细胞凋亡调控的重要蛋白。Bcl-2和Bax属于Bcl家族，Bax表达增加可促进线粒体细胞膜电位改变，促进细胞色素C释放，激活caspase途径促进细胞凋亡发生，而Bcl-2则通过与Bax结合形成异源二聚体发挥抗凋亡作用〔15〕。本研究显示，GPS预处理可减轻H2O2诱导H9C2细胞凋亡，提高Bcl-2表达，降低Cleaved caspase-3和Bax表达水平，提示GPS可能通过线粒体途径抑制H2O2诱导的H9C2细胞凋亡。

PI3K/AKT信号通路是调节细胞生存、生长和凋亡的重要细胞内信号通路〔16〕。研究显示，PI3K/AKT通路的激活可促进心肌细胞的存活，保护心脏免受缺血/再灌注损伤，抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡〔17,18〕。此外，GPS可能激活PI3K/AKT信号通路对人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤具有保护作用〔11〕。为探讨GPS对H2O2诱导的H9C2细胞损伤保护作用机制，本研究检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平，结果显示GPS预处理可降低H2O2诱导对PI3K、AKT磷酸化的抑制作用，提示GPS对H2O2诱导的H9C2细胞保护作用可能与激活PI3K/AKT信号通路有关。综上所述，GPS可减轻H2O2诱导的心肌细胞氧化应激损伤和凋亡，其机制可能与激活PI3K/AKT信号通路有关，这为GPS用于预防心肌细胞氧化应激损伤奠定了理论基础。