连翘苷对L-谷氨酸诱导的HT22细胞及APP/PS1小鼠的保护作用

胡馨予 孙晓琪 李志平

(1长春医学高等专科学校临床医学部，吉林 长春 130031；2吉林大学第一医院)

阿尔茨海默病(AD)是一种慢性神经退行性疾病〔1〕，主要发生在65岁以上的人群中，伴随着年龄的升高，患病率也显著提高〔2〕，目前，AD已成为中国患者的第五大死因，给患者及其家人带来巨大的精神伤害和经济负担。当前应用于AD的临床治疗药物主要用于缓解症状，并且功效有限〔3〕，因此挖掘可用于AD治疗的药物刻不容缓。连翘苷从天然植物连翘的果实中提取而得〔4〕，有抗感染、抗氧化、抗病毒等功效〔5〕，本研究通过L-谷氨酸(L-Glu)诱导的HT22细胞损伤模型和APP/PS1小鼠模型从体外和体内两方面探讨连翘苷的神经保护作用，为连翘苷应用于AD的临床研究提供理论基础和数据支持。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药物与试剂 连翘苷(CAS号：487-41-2，分析标准品，纯度≥98%)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自上海源叶生物科技有限公司；DMEM培养基、青霉素链霉素混合液购自索莱宝生物公司；胎牛血清购自四季青生物公司；胰蛋白酶购自Sigma公司；凋亡试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒购自默克密理博公司；二喹啉甲酸(BCA)试剂盒购自赛默飞世尔科技；二甲基亚砜(DMSO)、多聚甲醛购自阿拉丁公司；β淀粉样蛋白(Aβ)1～42抗体(ab201061)、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2基因相关启动子(Bad)抗体(ab32445)、BH3结构域凋亡诱导蛋白(Bid)抗体(ab62469)、Bcl-2抗体(ab182858)、大分子B淋巴细胞瘤(Bcl-XL)抗体(ab32370)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体(ab32503)均购自Abcam公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，E-AB-20032)、兔二抗(E-AB-1001)购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司。

1.1.2细胞株 小鼠海马神经元细胞系(HT22细胞)购自北纳生物(BNCC)。

1.1.3实验动物 8月龄SPF级APP/PS1小鼠36只；8月龄SPF级野生型(WT)小鼠12只，均购自南京生物医药研究院。

1.1.4仪器与设备 CO2培养箱购自赛默飞公司；酶标仪购自美国BioTek公司；流式细胞仪购自默克密理博公司；小鼠水迷宫测试仪购自成都泰盟公司；荧光倒置显微镜购自日本尼康公司。

1.2方法

1.2.1HT22细胞培养 将HT22细胞均匀铺在75 cm2贴壁细胞培养瓶中，置于37℃，含5%CO2培养箱中培养，待细胞达瓶底面积80%时进行传代，细胞传至第3代开始进行实验。

1.2.2MTT比色法检测细胞活力 将HT22细胞以5×103/孔的浓度铺于96孔板内。细胞分为7组，分别为空白组、模型组、5、10、20、40、80 μmol/L连翘苷组。24 h后，给药组分别给予5、10、20、40、80 μmol/L连翘苷预处理3 h，模型组和给药组细胞中加入L-Glu，使其终浓度为25 mmol/L，与细胞共同孵育24 h后，空白组、模型组和给药组细胞中加入20 μl浓度为5 mg/ml MTT，37℃孵育4 h后，弃去孔板中的液体，每孔加入200 μl DMSO，37℃孵育15 min,用酶标仪测定490 nm波长处光密度值。

1.2.3细胞凋亡检测 将HT22细胞以2×105/孔浓度铺于6孔板内。细胞分为4组，分别为空白组、模型组和5、20 μmol/L连翘苷组。24 h后分别给予5、20 μmol/L连翘苷预处理3 h，随后加L-Glu和连翘苷共同孵育24 h，给药结束后，弃去孔板内培养基，每孔加入0.4 ml胰酶，放于37℃ 二氧化碳培养箱中消化细胞，2 min后加入1 ml完全培养基终止消化，收集细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，细胞沉淀用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次后与凋亡试剂反应，通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.4线粒体膜电位检测 将HT22细胞以2×105/孔浓度铺于6孔板内。细胞分为4组，分别为空白组、模型组和5、20 μmol/L连翘苷组。24 h后分别给予5、20 μmol/L连翘苷预处理3 h，随后加L-Glu和连翘苷同时作用24 h，加入胰酶消化细胞，收集细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，细胞沉淀用PBS洗涤2次后与染色剂反应，通过流式细胞仪检测线粒体膜电位情况。

1.2.5APP/PS1小鼠给药 将APP/PS1小鼠随机分为3组，分别为模型组和5、20 mg/kg连翘苷组，用WT小鼠作为空白组，每组12只。适应性喂养1 w后开始给药，空白组和模型组口服生理盐水(10 ml/kg)，连续给药8 w。

1.2.6小鼠水迷宫测试 为评估小鼠的记忆能力，在给药7 w后进行水迷宫实验。在小鼠水迷宫装置中加入自来水，水面没过平台1 cm，水中加入适量的二氧化钛使水面浑浊。水温维持21～24℃，将小鼠先放在平台上适应30 s，随后将小鼠放入水中，小鼠找到平台后，在平台上停留30 s，若60 s内无法找到，则引导小鼠找到平台，停留30 s。训练4 d后进行测试，记录小鼠找到平台的时间和轨迹。

1.2.7小鼠解剖 小鼠给药8 w后经CO2吸入法进行安乐死处理，尾静脉取血，静置30 min后3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，3 000 r/min离心5 min，血清冻于-80℃备用。取小鼠脑组织，一半脑固定在4%多聚甲醛中，室温储存，另一半冻于-80℃备用。

1.2.8免疫组化检测Aβ水平 脑组织在室温固定24 h后，用乙醇梯度脱水，包埋后切成5 μm的薄片，脱蜡后在3%过氧化氢(H2O2)中孵育30 min，随后置于10%的山羊血清中室温封闭30 min，放在Aβ1～42抗体中4℃孵育12 h，PBS冲洗3次，每次8 min，再放入兔二抗中室温孵育1 h，再次用PBS冲洗3次，每次8 min，室温用染色剂染色15 min，脱水、封片后在荧光倒置显微镜下观察实验结果。

1.2.9Western印迹 取小鼠海马区组织10 mg左右，加入200 μl放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液充分匀浆，冰上裂解10 min后，12 000 r/min离心2次，每次5 min，取上清，通过BCA法对每组样品进行蛋白定量。以40 μg/泳道的量加入蛋白样品，用12%分离胶分离蛋白，随后转移至0.45 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，100 V，转移60 min，用5%牛血清白蛋白(BSA)在4℃下封闭5 h后分别放于Bad、Bax、Bcl-2、Bcl-XL和Bid抗体中，在4℃条件下孵育14 h，用洗涤缓冲液(TBST)洗涤孵育后的条带，洗5次，每次8 min，随后将条带放入山羊抗兔二抗中，在4℃条件下孵育4 h，再用TBST洗5次，每次8 min，洗涤结束后用增强型电化学发光(ECL)试剂覆盖在条带表面，并置于显影仪中拍照，用Image J1.8.0软件对结果进行光密度分析。

1.3统计学方法 采用DSS25.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1连翘苷对HT22细胞存活率的影响 与空白组细胞活力〔(100.00±6.26)%〕相比，模型组〔(55.74±4.51)%〕显著降低(P<0.001)；与模型组比较，5、10、20、40、80 μmol/L连翘苷组〔(68.82±5.43)%、(75.58±1.20)%、(87.15±4.47)%、(89.61±3.79)%、(95.28±2.18)%〕均显著升高，且20 μmol/L连翘苷组>10 μmol/L连翘苷组>5 μmol/L连翘苷组(P<0.01)；而20、40、80 μmol/L连翘苷组组间无显著差异(P>0.05)。选取5、20 μmol/L连翘苷组进行后续实验。

2.2连翘苷对HT22细胞凋亡的影响 与空白组细胞凋亡率〔(10.62±0.66)%〕相比，模型组〔(16.36±1.86)%〕显著升高(P<0.01)；与模型组比较，5、20 μmol/L连翘苷组〔(11.29±0.80)%、(8.41±1.08)%〕均显著降低(P<0.05)。见图1。

图1 连翘苷对HT22细胞凋亡的影响

2.3连翘苷对HT22细胞线粒体膜电位的影响 与空白组线粒体膜电位〔去极化(6.30±0.50)%〕相比，模型组〔去极化(14.88±0.28)%〕显著升高(P<0.001)；与模型组比较，5、20 μmol/L连翘苷组〔去极化(13.00±0.38)%、(8.82±0.35)%〕均显著降低(P<0.05)。见图2。

2.4连翘苷对APP/PS1小鼠行为学的影响 与空白组小鼠寻找平台的时间〔(19.92±7.85)s〕相比，模型组〔(52.64±7.95)s〕显著升高(P<0.001)；与模型组比较，5、20 mg/kg连翘苷组〔(41.90±10.11)s、(30.48±14.80)s〕均显著降低(P<0.01)。见图3。

2.5连翘苷对APP/PS1小鼠脑中Aβ的影响 与空白组小鼠大脑中Aβ斑块面积(1.00±0.10)相比，模型组(5.33±0.61)显著升高(P<0.001)；与模型组比较，5、20 mg/kg连翘苷组〔(3.67±0.99)、(2.47±0.45)〕均显著降低(P<0.01)。见图4。

图2 连翘苷对HT22细胞线粒体膜电位的影响

图3 连翘苷对APP/PS1小鼠水迷宫的影响

图4 连翘苷对APP/PS1小鼠脑中Aβ斑块的影响(DAB染色,×40)

2.6连翘苷对APP/PS1小鼠脑中凋亡相关蛋白的影响 与空白组相比，模型组Bad、Bax、Bid水平均显著升高，Bcl-2、Bcl-XL水平均显著降低(P<0.01)；与模型组比较，5、20 mg/kg连翘苷组Bad、Bax、Bid水平均显著降低，Bcl-2、Bcl-XL水平均显著升高(P<0.05)。见表1、图5。

表1 连翘苷对APP/PS1小鼠脑中Bcl-2家族蛋白的影响

1～4：空白组、模型组、5 mg/kg连翘苷组、20 mg/kg连翘苷组图5 连翘苷对APP/PS1小鼠脑中Bcl-2家族蛋白的影响

3 讨 论

AD已成为老年人发病率最高的疾病之一〔6〕。AD的发病过程中会发生神经元的大量凋亡〔7〕。AD常伴随着线粒体功能障碍的发生〔8〕。线粒体膜电位的失衡与氧化应激密切相关，进而会导致细胞凋亡的发生〔9，10〕。AD患者的空间认知能力和记忆力较差〔11，12〕。水迷宫是检测实验动物对空间的识别和记忆能力的经典实验〔9，13〕。大脑中Aβ斑块沉积是AD的显著病理特征〔14〕。Bcl-2家族蛋白能直接反映线粒体凋亡的水平，是线粒体功能障碍的显著标志物〔15，16〕，Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白两种〔17〕，Bad、Bax和Bid蛋白含量增加会促进细胞凋亡，相反，Bcl-2和Bcl-XL蛋白含量增加会抑制细胞凋亡，通常用Bcl-2/Bax来判断细胞的凋亡情况〔18〕。本研究结果说明连翘苷能通过抑制神经细胞的凋亡起到保护神经的作用。