同位素稀释液相色谱-串联质谱法和量子点荧光免疫层析法快速测定花生油中黄曲霉毒素B1的比较

莫紫梅，袁光蔚，王海波，陈宁周，宁 芯，江秋霞，韦春梦

(1.广西-东盟食品检验检测中心，广西 南宁 530022;2.玉林师范学院化学与食品科学学院，广西 玉林 537000)

黄曲霉毒素B1(AFB1)是黄曲霉毒素中最毒的一种，远高于氰化物和砷化物，它分布范围广，对大多数食品原料及成品均有一定程度的污染，且高温也很难将其破坏，是已知的最强致癌物之一，属于一类致癌物，对人们的健康及生活造成极大威胁[1]。因此，AFB1的检测受到高度重视。

目前AFB1的检测方法有：薄层分析法、液相色谱法、酶联免疫法、毛细管电泳法、荧光光度法以及免疫胶体金检测法等[1]。薄层分析法是一种半定量的检测方法，操作简单且价格低廉有效，通量高、准确、迅速；缺点为实验操作繁琐、检测时间较长、萃取和净化效果较低、灵敏度低、重现性差[1-4]。高效液相色谱法是目前常用的检测方法，它灵敏度高、特异性好、分离能力强、能够对样品准确定性；缺点为操作复杂、前处理时间长、检测仪器及费用昂贵[1-4]。酶联免疫法是将抗体(抗原)固定在聚苯乙烯材料上，然后加入酶标抗原(抗体)，抗原特异性结合抗体后，经显色底物反应显色，测定光学信号强度，从而确定待测物浓度[1，3，5]，其优点为准确、快速、定量、毒性小；缺点是检测少量样本时成本高、重复性较低、试剂需要低温保存，试验假阳性概率较高，需配备专门的酶标仪降低假阳性率[1]。毛细管电泳法是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术，它是依据样品中各组分之间的迁移速度和分配行为上的差异而实现对目标化合物的分离检测方法。其优点为该方法与激光减弱荧光检测器连用可提高灵敏度；缺点为检测操作复杂、检测成本相对较高，不适宜在试样检测中广泛应用[6]。荧光光度法是我国黄曲霉毒素检测的国标方法之一，利用黄曲霉毒素中各种不同类型毒素的荧光强弱程度之间的特性差异从而通过荧光光度计进行检测分析。其优点是检测迅速、灵敏度高、测定准确、适用于大量样品的检测。缺点是样品需经提取、净化、分离等操作，检测费用高、尚不能对单一的毒素进行检测[1-7]。免疫胶体金检测法是一种通过应用胶体金作为免疫反应示踪物质的新型抗原抗体特异反应的免疫标记技术。该检测方法的原理为：利用在 pH值呈弱碱性情况下，存在于非离子型溶液介质中，呈负电荷的胶体金与带正电荷的蛋白质分子基团结合，形成特定的免疫反应的标记物，从而进行检测，用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，根据抗原抗体特异性结合反应，可进一步检测黄曲霉毒素[1，4，8]。其优点为可对单份样品进行测定，操作简便，检测效率高，适合现场快速检测；缺点是只能达到半定量，复性较差，检测结果无法保存，只能作为快速筛查的手段[1]。

量子点作为近几年出现的新型荧光标记材料，因其具有发射光谱范围窄且对称，激发光谱范围宽，发射峰可调节尺寸[5]，稳定性好，信噪比高，生物相容性好，荧光寿命(20～50 ns)长于背景荧光的寿命(1～10 ns)，能够准确地检测和量化其荧光强度[5，8，9]。量子点荧光免疫层析法(QDs-based IFA)对人员的要求低，检测时间短，成本低且定量，但准确性低于液相色谱，已被广泛用于生物医药、微生物学、分析化学、食品等领域[10，14]。量子点荧光可通过调节发射峰尺寸实现单激发、多波长辐射，形成彩色 QDs，在标记多种真菌毒素的抗体后，可以实现同步检测食品中的AFT和其他毒素[15-19]，能够有效提高检测效率。

本试验采用同位素稀释液相色谱-串联质谱法(国标法)和量子点荧光免疫层析法定量检测花生油中AFB1的含量，通过2种方法的比较，确定量子点荧光免疫层析法检测花生油中AFB1的可行性和可靠性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1仪器与设备

QUINTIX313-ICEU电子天平，德国赛多利斯公司；RDTANA460R离心机，美国Thermo Fisher Scientific公司；Multi Reax多管式涡旋振荡器，德国海道夫公司；NepQD-Infinity-V1快速免疫荧光分析仪，江苏量点科技有限公司；Milli-Q 超纯水系统，美国Milli-pore公司；EBA 270离心机，德国Hettich科学仪器公司；Shimadzu DGU-20A超高效液相色谱仪，日本岛津公司；AB QTRAP 4500 MS四极杆质谱仪(配电喷雾离子源)，美国AB SCIEX公司。

1.1.2材料与试剂

磷酸盐缓冲液：8.00 g氯化钠、1.20 g磷酸氢二钠、0.20 g磷酸二氢钾、0.20 g氯化钾，用900 ml水溶解，用盐酸调节pH值至7.4，用水定容至1 000 ml；实验室用水为Milli-Q超纯水。甲醇、乙腈、甲酸、乙酸、乙酸铵(色谱纯)，德国默克股份公司；AFB1标准溶液、13C17-AFB1内标(纯度≥98%)、黄曲毒素免疫亲和柱，ROMER LABS有限公司。

1.2 方法

1.2.1量子点荧光免疫层析法

(1)样品前处理

取1 g花生油于15 ml离心管中，加入2 ml 70%甲醇水溶液，震荡5 min，6 000 g离心5 min，收集上清液。取上清液100 μl，与磷酸盐缓冲溶液600 μl振荡混匀，待上样检测。

(2)样品检测

将检测卡及待检样本取出，平衡至室温，开启NepQD-Infinity-V1快速免疫荧光分析仪。将检测卡加样孔朝上平放，移取的待检样本75 μl垂直缓慢滴入检测卡的加样孔中，反应15 min，将检测卡插入 NepQD-Infinity-V1/P1快速荧光分析仪，并进行检测。

1.2.2同位素稀释液相色谱-串联质谱法

(1)样品前处理

按GB 5009.22—2016[7]操作。称取5 g花生油于50 ml离心管中，加入100 μl同位素内标工作液(100 ng/ml)，振荡混匀后静置30 min，加入20 ml乙腈-水溶液(84+16)，涡旋混匀，振荡20 min，在6 000 r/min下离心10 min，上清液备用。准确移取 4 ml上清液，加入 46 ml 1% Trition X-100的PBS，混匀，经免疫亲和柱净化，采用甲醇洗脱，洗脱液在50℃下用氮气吹至近干，加入1.0 ml初始流动相，涡旋 30 s溶解残留物,0.22 μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。

(2)标准工作曲线

AFB1工作液的配制：精密称取一定量的AFB1标准品于容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，浓度为200 ng/ml。

13C17-AFB1同位素内标工作液：精密称取一定量的AFB1内标标准品于容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，浓度为100 ng/ml。

标准工作溶液的配制：准确移取AFB1工作液，同位素内标工作液适量，配制成浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0、25.0 ng/ml的系列标准溶液，其中内标浓度为 2.0 ng/ml。

(3)色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC©BEH C18柱(150 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱温：40℃；流速：0.3 ml/min；进样量：10 μl；流动相：A 为5 mmol/L乙酸铵溶液，B 为乙腈-甲醇(50+50)溶液；采用梯度洗脱程序，见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件

(4)质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正离子扫描(ESI+)；检测方式：多反应监测模式(MRM)；电喷雾电压(IS)：5 500 V；离子源温度：550℃；curtain gas(气帘气)为35.0 psi；gas1(雾化气)、gas2(辅助气)分别为55，55 psi。MRM相关参数设定见表2。

表2 黄曲霉毒素B1的保留时间、定性离子、定量离子与内标物等MRM相关参数设定

2 结果

2.1 线性范围、检出限、回收率及精密度

同位素稀释高效液相色谱-串联质谱的标准工作曲线为:Y=62 588X+2 827,相关系数R=0.999 6，表明在浓度0.1～25.0 ng/ml内线性关系良好，检出限0.02 μg/kg。

量子点荧光免疫层析法采用NepQD-Infinity-V1快速免疫荧光分析仪内置曲线，其线性方程为:Y=1.340 1X-1.672 44，相关系数R2=0.991 30，其中Y=ln(p/q)，p=OD/OD0，q=1-p，式中X为ln(目标物浓度)，OD为目标物反应值，OD0为目标物浓度为0的反应值均值。量子点荧光免疫层析检测花生油中AFB1的线性范围为0.5～25.0 μg/kg，检出限为0.5 μg/kg。

取阴性样品进行加标回收试验，设计3个不同水平，将AFB1标准溶液添加到空白花生油样品中，混合均匀，按照1.2.2 方法进行试验，同位素稀释高效液相色谱-串联质谱和量子点荧光免疫层析法的回收率分别为83.2%～94.6和78.6%～88.3%，精密度为1.5%～3.5%和1.6%～3.8%，(见表3)。根据 GB/T 27404—2008附录F[21]中的要求，回收率参考范围被测组分含量<0.1 mg/kg时，回收率范围在60%～120%，符合国标要求。

表3 2种检测方法线性方程、回收率、检出限比较

2.2 质控样及其精密度

采用2种方法对购买具有标准物质证书的质控样(特性值8.851 μg/kg，特性值区间 5.449～12.253 μg/kg)进行测定。结果表明，同位素稀释高效液相-串联质谱法和量子点荧光免疫层次法的结果分别为9.051 μg/kg及7.752 μg/kg，均在特性值区间范围内，符合要求。且对样品进行6次独立重复测试，其相对标准偏差分别为2.6%和3.7%，精密度均符合定量分析的要求，见表4。

表4 2种检测方法质控样测定结果

2.3 灵敏度、假阴性率

灵敏度是指方法在实验条件下达到实际最低检出水平时，检出阳性结果的阳性样品数占总阳性样品数的百分比。假阴性率是指方法在实验条件下达到实际最低检出水平时，阳性样品中检出阴性结果的最大概率(以百分比计)。根据食药监办科〔2017〕43号《食品快速检测方法评价技术规范》中计算公式，荧光量子点免疫层析法灵敏度及假阴性率见表5。

表5 荧光量子点免疫层析法灵敏度及假阴性率

在参比方法检测的所有阳性样本中：

参比方法的阳性样本数量(N1)=快检阳性数量(N11)+快检阴性数量(N12)。

灵敏度(p+，%)=快检阳性数量(N11)/(参比方法的阳性数量(N1))×100(其中参比方法的阳性数量=快检阳性数量+快检阴性数量)。

假阴性率(pf-，%)=快检阴性数量(N12)/参比方法的阳性数量(N1)×100。

本试验中，同位素稀释高效液相-串联质谱法为参比方法，量子点荧光免疫层析为快检方法。由表6可知，在试验的76批样本中，参比方法测定的阳性样本数为76批，量子点荧光免疫层析法检测的阳性样本数为70批，阴性样本数为6批，故荧光量子点免疫层析检测技术的灵敏度为92.1%，假阴性率为7.9%。

2.4 2种方法一致性的比较

参比方法阳性样本中AFB1含量的比较见表6。由表6可知，同位素稀释法高效液相-串联质谱法和量子点荧光免疫层析法检测的76批样品中，两种方法的相对偏差为0.05%～9.93%。对两种方法AFB1检测结果进行T检验，t=0.9 993，t双卫临尾(0.025,76)=2.291，t

表6 参比方法阳性样本中AFB1含量的比较

3 结论与讨论

量子点荧光免疫层析法检测花生油中AFB1的检出限、回收率、精密度均良好，且和国标检测方法同位素稀释高效液相-串联质谱法数据对比无显著性差异，符合国标要求。量子点荧光免疫层析法是基于量子点标记的抗原抗体反应，利用荧光分析仪测定卡上检测线和控制线的荧光强度，而且其样品提取简单，只需简单的振荡提取、离心、稀释后即可上机检测，且有内置曲线可快速读出结果。该方法具有分析时间短、步骤简单、结果可靠等优点，灵敏度、特异性均很好，适合现场快速检测，可在基层快检中推广应用，用于各地市场监管单位现场快速定量检测食用油中AFB1含量，同时也为该方法用于其它真菌毒素的定量荧光免疫检测提供了参考。