液相色谱法测定发酵液中阿魏酸酯酶的活力

程娇梅，齐祥明，郭晓华

(1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266000；2.青岛蔚蓝生物股份有限公司，山东 青岛 266000；3.山东美佳集团有限公司，山东 日照 276826)

阿魏酸酯酶，又称为肉桂酸酯酶，属于羧酸酯水解酶亚类，该酶可以水解植物细胞壁中由阿魏酸、对香豆酸及二聚阿魏酸等酚酸与半纤维素和木质素形成的酯键，打破它们形成的网状结构，将半纤维素和木质素分开，使纤维素酶可以与纤维素充分接触，大大提高纤维素的降解率。因此阿魏酸酯酶可以实现木质素、纤维素等的加速降解，同时还释放出阿魏酸、对香豆酸等抗氧化活性物质，在饲料、食品工业中具有广泛的应用前景[1]。

酶活力是酶制剂生产、应用中的关键定量指标。目前，阿魏酸酯酶的研究主要集中在产酶菌的筛选[2-3]、晶体结构研究[4]、基因表达[5]、发酵条件优化[2-6]、酶学性质研究[7]、应用[8-9]及与其他酶的协同作用[10]等。而这些研究中，涉及到阿魏酸酯酶酶活力测定的内容往往过于简单、含糊。目前可查的步骤清晰的阿魏酸酯酶酶活力测定方法还是十几年前报道的分光光度法[11-12]，该法易受样品中其他组分的干扰，测定准确度不高，且检测过程无法自动化，时间成本较高，无法满足阿魏酸酯酶发酵生产时的检测需求。

因此，本研究尝试基于该酶反应产物阿魏酸的液相色谱定量检测法，确定该酶活力的检测方法。酶活力测定的关键在于，通过液相色谱将底物阿魏酸甲酯和产物阿魏酸分离，实现对阿魏酸甲酯和阿魏酸两种物质含量的精确定量。在此基础之上，我们还对该酶的酶促反应条件进行了系统的研究，进而建立了操作简单、准确可靠的酶活力测定方法，为该酶制剂的生产技术开发及产业化应用提供酶活力检测方法上的支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阿魏酸酯酶：液体，由青岛蔚蓝生物集团有限公司提供。

阿魏酸：≥99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；阿魏酸甲酯：≥99.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、乙酸均为市售色谱纯；十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、一水合柠檬酸均为市售分析纯；分析用水为自制纯净水。

1.2 仪器与设备

e2695、2489高效液相色谱仪，美国沃特世公司；PHS-3E pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；TG16-WS高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；DK-98-IIA恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；QT-1漩涡混合器，上海琪特分析仪器有限公司。

1.3 分析方法

1.3.1酶活力定义及酶促反应步骤

阿魏酸酯酶酶活力定义：在一定的温度、pH值下，每分钟产生1 μmol阿魏酸，定义为1个酶活力单位，用U表示。

酶促反应步骤：取2支试管，加入1 ml稀释后的酶液，一定温度下预热5 min，然后加入1 ml阿魏酸甲酯溶液，反应一定时间，加入2 ml终止液，混匀，过0.22 μm的水系膜，用液相色谱仪测定反应后阿魏酸含量，计算阿魏酸酯酶酶活力。

阿魏酸酯酶酶活力计算公式：

式中，U为阿魏酸酯酶酶活力，U/ml；C为通过标准曲线算得的阿魏酸浓度，mg/L；0.004为反应总体积，L；1 000为mg与μg的转换系数；n为样品的稀释倍数；194.19为阿魏酸的摩尔系数，g/mol；t为反应时间，min；m为样品的量，ml。

1.3.2阿魏酸含量测定

色谱条件：色谱柱为安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18，流动相为甲醇∶1%乙酸溶液=70∶30，流速为1.0 ml/min，检测波长为254 nm，柱温为35℃，进样温度为25℃，进样量为10 μl，运行时间为5 min。

在该色谱条件下测定阿魏酸含量，对该方法的线性范围、检测限、定量限、重复性、加标回收率进行实验。

1.3.3酶活力测定过程中最适条件探索

终止液的确定：阿魏酸在弱酸条件下具有良好的稳定性，选择乙酸溶液作为终止液，配制质量分数分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%的乙酸溶液，在37℃，反应15 min后加入，放置0、10、20、30、60、120、150、180 min测定阿魏酸的含量，确定终止液能否彻底终止酶促反应。

阿魏酸生成量范围的确定：用pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸溶液将阿魏酸酯酶样品进行不同倍数的稀释，以0.416 g/L阿魏酸甲酯为底物，在37℃下，进行酶促反应，测定反应后阿魏酸含量，计算阿魏酸甲酯的残余率和单位酶的阿魏酸生成量。

最适温度的确定：用pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制浓度为0.416 g/L阿魏酸甲酯溶液，分别在30、35、40、45、50、55、60、65、70℃条件下，进行酶促反应15 min，计算每个温度下酶活力，做温度-酶活力曲线。

最适pH值的确定：分别用pH值为2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制0.416 g/L 阿魏酸甲酯溶液，在37℃下进行酶促反应15 min，计算每个pH值下酶活力，做pH值-酶活力曲线。

1.3.4阿魏酸酯酶酶活力测定方法验证

选取10个不同酶活力的样品，用pH5.0的缓冲液配制浓度为0.416 g/L的阿魏酸甲酯溶液，在55℃下进行酶促反应，计算每个样品的酶活力，重复测定5次，计算其RSD。

2 结果与讨论

2.1 高效液相色谱定量检测阿魏酸

实验首先确定较优的色谱条件：色谱柱为安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18，流动相为甲醇∶1%乙酸溶液=70∶30，流速为1.0 ml/min，检测波长为254 nm，柱温为35℃，进样温度为25℃，进样量为10 μl，运行时间为5 min。色谱出峰结果如图1所示。

图1 阿魏酸与阿魏酸甲酯色谱图

图1显示，在此条件下可实现阿魏酸与阿魏酸甲酯的有效分离。进一步探索可知，阿魏酸的检测限(S/N=3)为69.15 μg/L；定量限(S/N=10)为234.78 μg/L；在测酶活力拟采用的产物浓度范围10～100 mg/L内，线性度良好，R2=0.999 9。验证实验结果表明，该检测方法对阿魏酸标准样检测的重复性(RSD)小于1.0%；加标回收率为99.25%。

2.2 酶活力测定最适条件探索

在确定阿魏酸及阿魏酸甲酯的定量检测方法后，酶活的检测则基于对特定条件下过饱和的底物阿魏酸甲酯与阿魏酸甲酯酶样在特定条件(温度、pH值)下反应一定的时间(本试验选取反应时间为15 min)来进行。

2.2.1终止液乙酸浓度的确定

在酶活力测试过程中，当酶反应到达终点需采用恰当的方式终止反应才能为后续的反应产物定量提供有效的样品。通常酶活力测试的终止液往往采用该酶的抑制剂。因阿魏酸酯酶的抑制剂方面目前相关报道较少，因此本研究尝试采用低pH环境(用高浓度乙酸溶液来实现)促使蛋白质变性的方法来终止反应，结果如图2。

图2显示，当终止液乙酸浓度小于20%时，在其加入后的时间里，产物阿魏酸的含量仍呈逐步增长趋势，说明此时不能完全终止酶反应。乙酸浓度大于等于25%时，放置30 min，阿魏酸含量比较稳定；对4个终止液浓度下所测得的4组阿魏酸含量进行显著性分析，结果表明这些数据均无显著性差异(P>0.05)，说明浓度大于等于25%的乙酸溶液能终止酶反应。

图2 乙酸浓度与阿魏酸含量关系图

为了进一步考察酶促反应是不是彻底终止，选择延长放置时间，结果如图3所示。乙酸浓度为25%时，随着时间延长，阿魏酸含量还在增加，说明酶促反应终止的不彻底；乙酸浓度大于等于30%的3组，放置240 min，阿魏酸含量无明显变化。显著性分析结果表明，这3组数据在长时间背景下均无显著性差异(P>0.05)，说明酶促反应已被彻底终止。考虑高浓度乙酸溶液可能对仪器设备产生较大的损坏，最终选择30%乙酸溶液作为终止液。

图3 乙酸浓度与阿魏酸含量关系图

2.2.2产物阿魏酸生成量控制范围

实验中阿魏酸甲酯加入量已提前设定，如测试体系中阿魏酸酯酶酶活较高则可能出现底物过饱和度不够。根据酶反应动力学，此时的产物生成量将不与酶活之间呈线性关系。本方法为防止这一问题出现，采用对酶样提前稀释的做法。根据上述机理，只要稀释后产物阿魏酸的生成量得到较好的控制，则在特定阿魏酸甲酯加入量下，测试体系的反应动力学仍在线性区。为此本研究对试验条件下阿魏酸生成量范围进行了探索，结果如图4所示。

图4 单位酶的阿魏酸生成量

图4所示为某待测样品在不同稀释倍数下的阿魏酸甲酯残余率和单位酶的阿魏酸生成量。结果显示，当稀释倍数小于7 500倍时，单位酶的阿魏酸生成量随着稀释倍数的增加而增加，阿魏酸甲酯残余率也在增加(从20.8%提升至71.3%)。这首先说明稀释倍数小于7 500倍时，阿魏酸甲酯过饱和度明显不够。其次，所计算出的阿魏酸生成量其实就和后续的阿魏酸酯酶酶活测量结果是线性相关，此时该数字并未稳定，说明该区域不是可以进行酶活测试的适宜区域。

随着稀释倍数的继续增加，单位酶的阿魏酸生成量和阿魏酸甲酯残余率均不再明显增加，而是保持在一个比较稳定的水平。统计分析结果表明，这些数据已无显著性差异(P>0.05)。在此条件下，对反应后体系中的阿魏酸生成量进行检测分析，结果表明，当该值在15～25 mg/L时，酶活测量结果(即单位酶的阿魏酸生成量)稳定。

2.2.3温度的确定

温度与酶活力关系见图5。

图5 温度与酶活力关系

由图5可见，酶样在各温度下的活力测量结果。在30～55℃时，酶活力随着温度增加而增加，55℃时酶活力达到最高；在55～70℃时，酶活力随着温度增加逐步下降。以上数据说明，55℃是该酶样的最适温度。为使酶活测定结果具有尽可能高的精确度，酶活力测定过程中反应温度一般选择55℃。

2.2.4pH值的确定

图6所示为酶样在各pH值下的活力测量结果。pH值在2.0～5.0时，酶活力随着pH值的增加而增加，pH5.0时，酶活力测量值达到最大；pH值在5.0～8.0时，酶活力随pH值增大而下降。以上数据说明，pH5.0是该酶最适pH值。因此，为使酶活测定结果具有尽可能高的精确度，酶活力测定过程中pH值一般选择5.0。

图6 pH与酶活力关系

2.3 阿魏酸酯酶酶活力测定方法验证

在上述确定的酶反应条件下，本实验对10个阿魏酸酯酶样品进行了酶活力测定实验，结果表明酶活力测定值的RSD均小于3.0%(见表1)，符合酶制剂检测方法建立的要求，证明了高效液相色谱法测定阿魏酸酯酶酶活力的方法是准确可靠的。

表1 阿魏酸酯酶酶活力测定方法验证

3 结论

本研究以阿魏酸甲酯为底物，拟通过反应后生成物阿魏酸的含量来进行酶活测定。所研究方法首先基于Waters高效液相色谱仪(E2695、2489)，采用ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱，建立了阿魏酸定量方法。该方法以甲醇∶1%乙酸=70∶30作为流动相，等度洗脱(柱温35℃，流速1.0 ml/min，进样量10 μl)，在254 nm下测定阿魏酸含量，其检测限为69.15 μg/L，定量限为234.78 μg/L。待测酶活拟选产物阿魏酸的浓度在10～100 mg/L线性度良好(R2=0.999 9)，重复性(RSD)小于1.0%，加标收回率为99.25%。

在高效液相色谱法测定阿魏酸含量的基础上，本研究进一步建立了阿魏酸酯酶酶活力测定方法。试验首先选择了简便易得的乙酸溶液作为终止液，确定了终止液乙酸浓度为30%，进而确定当体系内阿魏酸生成量在15～25 mg/L范围时，酶反应动力学处于线性区，可用于酶活测定。最后确定酶样的最适温度为55℃，最适反应pH值为5.0。在该条件下，对阿魏酸酯酶酶活力测定方法进行验证，10个样品酶活力测定值的RSD均小于3.0%，说明高效液相色谱法测定阿魏酸酯酶酶活力是准确可靠的。