DOCK1通过AMPK/mTOR通路对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡和自噬的调控机制研究

李 丹，张忠山，李洵婷，曹苏娟（湘南学院附属医院肿瘤科，湖南郴州 423000）

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)起源于骨髓造血组织，是浆细胞过度增生所致的恶性肿瘤，多发于40～60岁中年男性[1-2]。了解MM发病机制和分子改变对改善患者生存质量具有重要意义。近年研究发现，胞质分裂作用因子1（dedicator of cytokinesis 1，DOCK1）在乳腺癌、肝癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中表现出的促癌基因属性，能够促进肿瘤细胞生长、侵袭、转移等生物学过程，且与部分实体瘤患者不良预后相关[3-5]。另研究还发现，DOCK1可抑制白血病SKM-1细胞生长、诱导细胞凋亡，在骨髓增生异常综合征向急性髓系白血病的转化中扮演促进作用[6]。PAN等[7]研究报道，依诺肝素通过抑制DOCK1表达及波形蛋白磷酸化和Akt激活，可使非小细胞肺癌对吉非替尼的敏感度增加，提示DOCK1可能是一个新的肿瘤治疗靶标。因此探究DOCK1在MM中的作用及机制可为MM的临床治疗提供新的方向。腺苷酸活化蛋白激酶（5’-AMP activated protein kinase,AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路和氧化应激在肿瘤生长、凋亡等过程中发挥重要作用[8]。研究发现，MM细胞株存在AMPK的磷酸化激活，在紫檀烯治疗前使用AMPK抑制剂Compound C进行预处理可诱导MM细胞凋亡[9]。基于既往研究报道DOCK1的癌基因属性，本研究观察了DOCK1在MM中的表达及其对癌细胞增殖、凋亡及自噬的作用，并探讨了DOCK1是否可通过调控AMPK/mTOR通路参与调节MM细胞的增殖、凋亡和自噬，以期为MM的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 人多发性骨髓瘤细胞株U266，RPMI 8266及人正常骨髓细胞MNC均购自中国科学院细胞库，接种于含10g/dl胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37℃，5ml/dl CO2恒温细胞培养箱中培养，每隔24～48 h更换培养基1次，待细胞生长至对数生长期时进行后续实验。另选取本院收治的多发性骨髓瘤患者及同期行骨髓穿刺并明确骨髓功能无异常的非血液病健康患者骨髓组织，各20例，检测骨髓组织中DOCK1表达情况。

1.2 仪器与试剂 胎牛血清，RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）；Trizol试剂，Lipfetamine2000（美国Invitrogen公司）；逆转录盒（日本Takara公司）；CCK-8试剂盒，Annexin V/PI凋亡试剂盒（中国贝博生物）；RIPA裂解液，PMSF蛋白酶抑制剂，BCA蛋白质测定试剂盒，SDS-PAGE凝胶速配试剂盒（碧云天生物科技公司）；GAPDH单克隆抗体，Bax单克隆抗体，Bcl-2单克隆抗体（美国Abcam公司）；c-Myc单克隆抗体，cyclin D1单克隆抗体，LC3II单克隆抗体，P62单克隆抗体，AMPK/p-AMPK单克隆抗体及mTOR/p-mTOR单克隆抗体（美国CST公司）；DOCK1沉默慢病毒（LVDOCK1-shRNA），阴性对照慢病毒（LV-NC）及重组人DOCK1过表达质粒hDOCK1-pCXN2-Flag（上海吉凯生物技术有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 细胞转染：取对数生长期待测细胞，以50 μl/孔接种于24孔板，分别加入3个LV-DOCK1-shRNA，LV-NC慢病毒及重组人DOCK1过表达质粒hDOCK1-pCXN2-Flag，室温静置15 min后加入500 μl新鲜培养基，孵育24 h，离心弃上清，加入500 μl新鲜培养基继续培养；于病毒感染第6天，加入0.3 μg/ml嘌呤霉素，连续培养72 h，换成不含嘌呤霉素的新鲜培养基培养2天；在倒置荧光显微镜下观察转染多发性骨髓瘤细胞荧光强度，当转染率＞70%，细胞可用于后续实验，选取LV-DOCK1-shRNA转染效率最显著的一组进行后续研究。实验分组：主要设为空白对照组，LVDOCK1-shRNA转染组，LV-NC（阴性对照组）及LV-DOCK1-shRNA+DOCK1过表达（hDOCK1组）共转染组。

1.3.2 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测 DOCK1 mRNA相对表达 ：按照Trizol试剂说明书提取细胞总RNA，使用逆转录试剂盒合成cDNA，引物由上海生工生物科技有限公司设计合成，DOCK1引物序列为Forward: 5’-GGATGACCTGGA GAAGGAG-3’，Reverse：5’-CGCAGGGGACTTA TCGT-3’；GAPDH引物序列为Forward：5’- ACGG ATTTGGTCGTATTGG-3’，Reverse：5’- TCCCGTT CTCAGCCTTG-3’。配置20 μl PCR反应体系，反应条件为95 ℃ 30 s，95 ℃ 5s，60 ℃ 30s，循环40次。以2-ΔΔCt计算相对表达量，ΔCt=Ct目的基因－Ct内参，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

1.3.3 CCK-8法检测细胞增殖活性：取对数生长期细胞，离心后重悬细胞沉淀，以5×104个/ ml的细胞密度接种于96孔板，每孔50 μl细胞悬液，分别培养24，48，72 h 时，每孔加入10 μl CCK-8 试剂，37 ℃继续培养 2 h，使用酶标仪检测450 nm处各孔吸光度值（A值）。

1.3.4 流式细胞术检测细胞凋亡：收集各组待测细胞，低速离心5 min，用PBS洗涤细胞2次，加入缓冲液收集细胞悬液，洗涤混匀后，取200 μl细胞悬液至流式细胞管，按试剂盒说明书中建议的试剂体系用量依次加入5 μl Annexin V-FITC及5 μl PI后轻轻混匀，在室温下避光孵育15 min，采用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。

1.3.5 Western blot 检测相关蛋白表达：收集待测细胞，加入适量的RIPA裂解缓冲液，离心后提取细胞内总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度。用10 g/dl SDS-PAGE上样缓冲液电泳分离所有蛋白，转移至PVDF膜上，室温下摇床封闭1 h，分别加入增殖相关蛋白c-Myc，cyclin D1；凋亡相关蛋白Bax，Bcl-2；自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I，P62及AMPK/mTOR通路相关蛋白AMPK，p-AMPK，mTOR，p-mTOR和内参GAPDH孵育过夜。用TBST清洗5次后，在室温下用二抗孵育1 h。然后再次用TBST清洗膜3次后采用电化学发光法（ECL）显色，观察目标蛋白灰色条带。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0处理数据，计量资料结果以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；癌组织及癌旁正常组织中表达差异比较采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MM组织及细胞中DOCK1相对表达 RTqPCR检测显示，MM细胞U266，RPMI 8266中DOCK1相对表达分别为9.84±2.56和8.67±2.42，明显高于人正常骨髓细胞MNC1.32±0.56，差异有统计学意义（F=15.088，P＜0.05）；同时检测发现，MM患者骨髓组织中DOCK1相对表达（0.57±0.16）也明显高于健康患者（2.84±0.73 ），差异有统计学意义（t=13.458，P＜0.001）。表明DOCK1在多发性骨髓瘤中显著高表达。

2.2 DOCK1转染效果验证 见表1。RT-qPCR检测显示，转染LV-DOCK1-shRNA2组和LV-DOCK1-shRNA3组U266细胞中DOCK1 mRNA和蛋白表达水平均较空白对照组明显降低，其中LV-DOCK1-shRNA2组降低最为显著，差异有统计学意义（tmRNA=8.499,6.455；t蛋白=9.712,6.475，均P＜0.05）；LVDOCK1-shRNA1组和阴性对照组U266细胞中DOCK1 mRNA和蛋白表达与空白对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。RPMI 8266细胞中DOCK1 mRNA水平和蛋白表达水平变化与U266细胞一致，以转染LV-DOCK1-shRNA2组降低最为显著（tmRNA=8.312,6.672；t蛋白=10.114,8.141，均P＜0.05）。表明敲低DOCK1表达转染成功，后续实验中选择LV-DOCK1-shRNA2进行研究。

表1 DOCK1在U266，RPMI 8266细胞中的表达（±s, n=3）

表1 DOCK1在U266，RPMI 8266细胞中的表达（±s, n=3）

细胞 表达水平 空白对照组 阴性对照组 LV-DOCK1-shRNA1组LV-DOCK1-shRNA2组LV-DOCK1-shRNA3组 F P U266 mRNA 1.01±0.10 1.26±0.19 1.23±0.19 0.22±0.05 0.41±0.09 53.572 ＜0.001蛋白 1.00±0.10 1.22±0.15 1.20±0.14 0.16±0.02 0.44±0.06 61.198 ＜0.001 RPMI 8266 mRNA 0.98±0.09 1.16±0.15 1.13±0.16 0.22±0.04 0.37±0.07 47.146 ＜0.001蛋白 1.02±0.11 1.25±0.13 1.23±0.13 0.20±0.03 0.36±0.05 75.204 ＜0.001

2.3 敲低DOCK1抑制细胞的增殖能力 见表2。CCK-8法检测显示，LV-DOCK1-shRNA2组的U266，RPMI 8266细胞增殖率在24，48和72 h均显著低于空白对照组（tU266=11.840，5.466，5.360；tRPMI8266=10.788，6.802，6.617，均P＜0.05）和阴性对照组，差异均有统计学意义（补充t值），阴性对照组和空白对照组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表3。Western blot检测结果显示，LV-DOCK1-shRNA2组 的U266，RPMI 8266细 胞增殖相关蛋白c-Myc，cyclin D1表达水平也显著低于空白对照组，差异均有统计学意义（tU266=8.212，10.271；tRPMI8266细胞=11.676，8.135，均P＜0.05）和阴性对照组（补充t值），阴性对照组和空白对照组差异亦无统计学意义（均P＞0.05）。

表2 低DOCK1对细胞增殖的影响（±s, n=3）

表2 低DOCK1对细胞增殖的影响（±s, n=3）

细胞 时间（h） 空白对照组 阴性对照组 LV-DOCK1-shRNA2组 F P U266 24 0.71±0.05 0.74±0.06 0.26±0.02 100.108 ＜0.001 48 1.13±0.10 1.21±0.13 0.68±0.06 24.089 ＜0.001 72 1.45±0.12 1.50±0.14 0.92±0.10 21.130 0.002 RPMI 8266 24 0.65±0.05 0.73±0.06 0.24±0.02 95.677 ＜0.001 48 1.18±0.10 1.30±0.13 0.62±0.06 38.872 ＜0.001 72 1.51±0.12 1.62±0.14 0.87±0.09 35.067 ＜0.001

表3 敲低DOCK1对细胞中增殖相关蛋白c-Myc，cyclin D1的影响（±s, n=3）

表3 敲低DOCK1对细胞中增殖相关蛋白c-Myc，cyclin D1的影响（±s, n=3）

细胞 蛋白 空白对照组 阴性对照组 LV-DOCK1shRNA2组 F P U266 c-Myc 1.00±0.09 1.16±0.18 0.22±0.01* 56.061 ＜0.001 cyclin D1 1.01±0.10 1.05±0.10 0.31±0.03* 71.584 ＜0.001 RPMI 8266 c-Myc 1.04±0.11 1.06±0.09 0.25±0.02* 93.248 ＜0.001 cyclin D1 1.02±0.10 1.21±0.12 0.41±0.03* 62.146 ＜0.001

2.4 敲低DOCK1促进细胞的凋亡和自噬 见表4。流式细胞术检测显示，LV-DOCK1-shRNA2组的U266，RPMI 8266细胞凋亡率24，48h均 显著高于空白对照组，差异均有统计学意义（tU266=11.020，9.815；tRPMI8266=9.814，10.346， 均P＜0.05）和阴性对照组（补充t值），阴性对照组和空白对照组比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表5。Western blot检测显示，与空白对照组和阴性对照组比较，LV-DOCK1-shRNA2组的U266，RPMI 8266细胞凋亡相关蛋白Bax表达水平明显升高，Bcl-2表达水平明显降低（tU266=11.616，5.587；tRPMI8266=10.717，4.236，均P＜0.05）；自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I表达水平明显升高，P62表达水平明显降低，差异均有统计学意义（tU266=14.697，6.340；tRPMI8266=15.940，6.701，均P＜0.05）。阴性对照组和空白对照组比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。

表4 敲低DOCK1对细胞凋亡率的影响（±s, n=3）

表4 敲低DOCK1对细胞凋亡率的影响（±s, n=3）

细胞 时间（h） 空白对照组 阴性对照组 LV-DOCK1-shRNA2组 F P U266 24 4.78±0.62 5.52±0.85 19.35±2.60* 77.051 ＜0.001 48 5.01±0.64 5.88±0.89 24.87±4.15* 61.533 ＜0.001 RPMI 8266 24 4.26±0.59 4.98±0.62 17.32±2.69* 60.868 ＜0.001 48 4.57±0.60 5.38±0.71 22.61±3.58* 68.306 ＜0.001

表5 敲低DOCK1对细胞凋亡、自噬相关蛋白表达的影响（±s, n=3）

表5 敲低DOCK1对细胞凋亡、自噬相关蛋白表达的影响（±s, n=3）

细胞 蛋白 空白对照组 阴性对照组 LV-DOCK1-shRNA2组 F P U266 Bax 0.72±0.06 0.67±0.06 2.48±0.31 92.588 ＜0.001 Bcl-2 1.37±0.14 1.40±0.15 0.79±0.08 21.940 0.002 LC3-II/LC3-I 0.98±0.09 0.91±0.09 4.22±0.45 147.178 ＜0.001 P62 2.59±0.42 2.56±0.39 0.84±0.12 26.342 0.001 RPMI 8266 Bax 0.80±0.09 0.66±0.08 2.67±0.35 82.736 ＜0.001 Bcl-2 1.19±0.20 1.30±0.22 0.58±0.07 14.511 0.005 LC3-II/LC3-I 0.94±0.10 0.87±0.09 4.04±0.39* 173.300 ＜0.001 P62 2.28±0.32 2.35±0.31 0.85±0.08* 31.477 ＜0.001

2.5 DOCK1 对AMPK/mTOR通路相关蛋白表达的影响 见表6。Western blot检测显示，与空白对照组和阴性对照组相比，LV-DOCK1-shRNA2组的U266，RPMI 8266细胞中AMPK/mTOR通路相关蛋白p-AMPK表达水平明显升高（tU266=9.804，tRPMI8266细胞=9.749，均P＜0.05），p-mTOR表达水平明显降低（tU266= 9.468，tRPMI8266细胞=9.959，均P＜0.05），AMPK和mTOR表达无显著变化；阴性对照组和空白对照组比较差异无统计学意义（均P＞0.05），提示DOCK1 参与MM发生可能与其调控AMPK/mTOR通路有关。与LV-DOCK1-shRNA2+ hDOCK1组比较，LV-DOCK1-shRNA2组的U266，RPMI 8266细胞中AMPK/mTOR通路相关蛋白p-AMPK表达水平明显升高（tU266=7.749，tRPMI8266细胞=6.927，均P＜0.05），p-mTOR表达水平明显降低（tU266= 7.674，tRPMI8266细胞=7.215，均P＜0.05）。为验证DOCK1是否真能调控AMPK/mTOR通路发挥作用，研究在U266，RPMI 8266细胞的LV-DOCK1-shRNA2组中转染重组人hDOCK1-pCXN2-Flag质粒使DOCK1表达恢复，发现p-AMPK和p-mTOR表达水平也被逆转得到恢复，见表6。证实DOCK1 确实可调控AMPK/mTOR通路来影响多发性骨髓瘤的发生。

表6 DOCK1 对AMPK/mTOR通路蛋白表达的影响（±s, n=3）

表6 DOCK1 对AMPK/mTOR通路蛋白表达的影响（±s, n=3）

细胞 蛋白 空白对照组 阴性对照组 LV-DOCK1-shRNA2组 LV-DOCK1-shRNA2+ hDOCK1组 F P U266 p-AMPK 1.00±0.12 1.14±0.11 2.67±0.30 1.35±0.24 40.542 ＜0.001 AMPK 1.02±0.10 1.00±0.09 1.04±0.12 1.03±0.11 0.079 0.970 p-mTOR 1.26±0.17 1.20±0.15 0.31±0.03 1.08±0.09 38.707 ＜0.001 mTOR 1.03±0.11 1.01±0.11 1.01±0.10 1.02±0.08 0.027 0.993 RPMI 8266 p-AMPK 1.01±0.09 1.08±0.10 2.91±0.37 1.56±0.27 40.892 ＜0.001 AMPK 1.04±0.13 1.10±0.12 1.13±0.15 1.11±0.14 0.245 0.862 p-mTOR 1.34±0.15 1.31±0.14 0.36±0.04 1.07±0.12 43.002 ＜0.001 mTOR 1.00±0.10 1.01±0.12 0.96±0.09 0.99±0.08 0.144 0.931

3 讨论

DOCKs家族是一类具有鸟嘌呤核苷酸交换因子活性的蛋白家族，共包含11个家族成员[10]。其中DOCK1异常是多种免疫缺陷疾病的重要原因，既往研究报道DOCK1基因的异常表达与某些肿瘤的发病机制、治疗和预后相关[11-12]，DOCK1过表达可促进多种实体瘤的生长、转移、侵袭等。除了在实体瘤中的促癌作用，有研究发现，DOCK1的过表达可导致急性髓系白血病的不良预后，其可能与干细胞特性、细胞增殖、迁移和趋化相关[13]。但目前DOCK1对MM的作用未曾涉及到。本研究首先探讨了DOCK1对MM细胞增殖活性的影响，发现敲低DOCK1表达显著抑制了MM细胞的增殖，促进了细胞凋亡，提示DOCK1在MM中扮演促癌基因角色。

自噬是一种高度保守的由应激诱导的能量代谢过程，在饥饿时通过降解回收细胞质内物质和细胞器而得以存活，对细胞是一种保护机制[14]。但近年来研究发现，细胞自噬在肿瘤发生发展中发挥既促进、又抑制的双重作用，一方面自噬可以作为一种防御机制，防止胞质内受损细胞器和代谢产物的堆积，保护受损的肿瘤细胞；另一方面，当细胞过度自噬时可作为肿瘤的抑制机制，与凋亡共同促进细胞死亡[15-16]。因此如何通过调节自噬达到抗肿瘤的目的仍需要更深层次的研究。LC3是检测自噬活性最为常用的标志蛋白，研究表明在自噬过程中LC3-I会转化为LC3-II，LC3-II表达量与发生自噬的程度呈正比[17]。自噬上游表达增强或者下游降解阻断，都会导致P62的聚集，最终P62会纳入成熟的自噬体内，并在自噬体内降解，表明P62表达水平与自噬负相关，通常P62的水平与LC3-II/LC3-I的大小结合起来作为评价自噬水平的高低[18]。而本研究检测结果显示，敲低DOCK1表达明显促进了MM细胞自噬相关蛋白LC3-II的表达，而抑制了P62表达水平，提示DOCK1低表达可诱导MM细胞的自噬。

相关文献报道[19]，二甲双胍通过靶向AMPK/mTORC1和mTORC2通路可诱导骨髓瘤细胞自噬和G0/G1期细胞周期阻滞。AMPK/mTOR通路在细胞增殖、代谢、凋亡、基因转录和细胞迁移中等发挥关键作用，AMPK在多种肿瘤中起到抑癌作用，激活AMPK可抑制mTOR磷酸化，发挥抗肿瘤效应[20]。本研究探究发现，敲低DOCK1表达后AMPK/mTOR通路相关蛋白p-AMPK表达水平明显升高，p-mTOR表达水平明显降低；再次转染恢复DOCK1表达后， AMPK和mTOR磷酸化水平被逆转，提示DOCK1可能通过调控AMPK/mTOR通路，进而调节 MM细胞的增殖、凋亡和自噬，参与MM的发生发展。然肿瘤发生机制复杂，DOCK1调控AMPK/mTOR通路影响MM发生的机制还需更进一步的研究去探究证实。

综上所述，DOCK1高表达可促进MM细胞增殖，抑制细胞的凋亡和自噬，其可能通过调控AMPK/mTOR信号通路参与了MM的发生发展，DOCK1有望成为治疗MM的潜在靶点。