类风湿关节炎患者血清DKK-1，CCL21水平与体液免疫指标的相关性研究

刘素芳，赵 阳，贾 彬，李俊芳（邯郸市中心医院免疫科，河北邯郸 056001）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种自身免疫性疾病，影响全球约1%的人口[1]，以滑膜炎、血管翳形成、关节软骨和骨破坏为主要病理表现，可导致慢性疼痛和功能障碍[2]。现有研究显示RA患者普遍存在体液免疫功能异常，体液免疫紊乱是RA发病的主要原因和关键环节[3]。Dickkopf-1（DKK-1）是内源性Wnt信号通路拮抗剂，可抑制成骨细胞分化，促使破骨细胞生成，导致骨量流失[4]，参与类风湿关节炎发病过程[5]。趋化因子（chemokine, CCL）21是趋化因子家族成员，可介导细胞间黏附和白细胞迁徙，诱导免疫和炎症损伤，现有研究结果表明RA患者外周血CCL21水平均增高[6]，提示CCL21参与RA发病。本研究通过检测RA患者血清DKK-1，CCL21水平以及免疫球蛋白（immunoglobulin ，Ig）、补体含量，探讨其间关系，旨在为临床诊治提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本研究获得邯郸市中心医院免疫科伦理委员会批准，选择2018年3月～2020年6月邯郸市中心医院免疫科收治的120例RA患者，纳入标准：①符合RA诊断和分类标准[7]；②本研究所需实验室检测项目结果完整；③年龄＞18周岁。排除标准：①强直性脊柱炎、骨关节炎、痛风、骨肿瘤；②并发其它部位恶性肿瘤、心脑血管疾病；③并发哮喘、过敏性鼻炎、自身免疫性肝病等其它自身免疫性疾病。根据28个关节疾病活动度（DAS28）评分分为低度组（2.6～3.2分，38例），中度组（3.3～5.1分，50例）和重度组（＞5.1分，32例）[7]。低度组：女性25例，男性13例，年龄41～69（56.35±10.26）岁，RA病程3～9（6.65±1.81）年；中度组：女性35例，男性15例，年龄36～71（56.60±10.19）岁，RA病程5～12（7.98±2.21）年；重度组：女性22例，男性10例，年龄39～70（56.12±10.02）岁，RA病程8～19（10.65±3.81）年。另选择同期我院门诊体检的117例健康志愿者为对照组，均排除骨创伤、骨关节炎以及风湿和类风湿疾病，女性75例，男性42例，年龄42～78（56.85±10.41）岁。四组受试者均知情同意并签署同意书，年龄、性别比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 仪器与试剂 意大利BIOBASE2000全自动酶免分析仪，CCL21试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司，批号2633JK）；DKK-1试剂盒（北京荣志海达生物科技有限公司，批号180513）；IgA，IgG，IgM，IgE，补体C3，补体C4试剂盒（美国Epitope Diagnostics公司，试剂盒批号AM1805）。

1.3 方法 所有受试者均采集静脉血3ml注入干燥试管（RA患者入院第2天，体检者体检当日），血液自然凝固后离心（转速3 000r/min，半径15cm，时间5min），留取血清备用。采用酶联免疫吸附试验检测血浆DKK-1，CCL21水平；免疫透射比浊法检测血清IgA， IgG， IgM， IgE，补体C3和补体C4。

1.4 统计学分析 采用SPSS 25.00进行数据分析，K-S法检验计量资料拟合优度，连续性变量以均数±标准差（±s）表示，性别以例表示，分别采用单因素方差分析（两两对比采用LSD-t检验），χ2检验。Pearson相关系数描述DKK-1，CCL21与IgG，IgA，IgM，IgE，补体C3，补体C4之间相关性，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 血清DKK-1，CCL21水平比较 见表1。RA组血清DKK-1，CCL21水平高于对照组（t=18.435，32.803，P＜0.05）。重度组血清DKK-1，CCL21水平高于中度组和轻度组（t=6.709，8.461；37.111,40.935，均P＜0.05），中度组血清DKK-1，CCL21水平高于轻度组（t=14.058,14.933，均P＜0.05），差异均有统计学意义。

表1 各组血清DKK-1，CCL21水平比较(±s，pg/ml)

表1 各组血清DKK-1，CCL21水平比较(±s，pg/ml)

项目 RA组（n=120）轻度组（n=138）中度组（n=150）重度组（n=132）对照组（n=117） F值 P值DKK-1 72.14±15.26 59.15±2.34 74.90±6.59 83.26±3.09 43.26±7.46 105.665 0.000 CCL21 285.16±32.16 258.15±4.06 289.75±12.54 310.06±6.45 170.06±20.41 96.351 0.000

2.2 免疫球蛋白和补体比较 见表2。RA患者血清IgG，IgA，IgM水平高于对照组（t=13.402，30.852，10.061，均P＜0.05），补体C3，补体C4水平低于对照组（t= 12.502，17.579，均P＜0.05）,IgE与对照组比较差异无统计学意义（t=0.148，P＞0.05）。重度组血清IgG，IgA，IgM水平高于中度组和轻度组（t=9.296, 6.322, 8.451；162.999,67.177, 64.106，均P＜0.05），补体C3，补体C4水平低于中度组和轻度组（t=11.206, 5.536；44.909,45.847，均P＜0.05），中度组血清IgG，IgA，IgM水平高于轻度组（t=15.608, 12.993, 17.468，均P＜0.05），补体C3，补体C4水平低于轻度组（t=18.607,10.527，均P＜0.05），差异均有统计学意义。

表2 各组免疫球蛋白和补体水平比较（±s）

表2 各组免疫球蛋白和补体水平比较（±s）

项目 RA组（n=120）轻度组（n=38）中度组（n=50）重度组（n=32）对照组（n=117） F值 P值IgA（g/L） 3.65±0.52 3.16±0.02 3.71±0.26 4.14±0.03 2.02±0.24 53.261 0.000 IgM（g/L） 1.95±0.42 1.57±0.03 2.03±0.16 2.28±0.06 1.42±0.39 69.652 0.000 IgG（g/L） 16.35±4.56 12.03±0.21 17.40±2.11 19.84±0.68 10.35±1.65 42.135 0.000 IgE（mg/L） 163.68±23.67 163.26±22.11 163.32±21.43 164.74±20.40 163.23±23.15 0.869 0.000补体C3（g/L） 1.05±0.16 0.91±0.02 1.07±0.05 1.18±0.02 1.39±0.25 46.351 0.000补体C4（g/L） 0.15±0.07 0.09±0.01 0.16±0.04 0.20±0.01 0.36±0.11 68.195 0.000

2.3 DKK-1，CCL21与体液指标的相关性 见表3。RA患者血清DKK-1，CCL21水平与IgG，IgA，IgM呈正相关（P＜0.05），与补体C3，补体C4水平呈负相关（P＜0.05），与IgE无相关性（P＞0.05）。

表3 DKK-1，CCL21与体液指标的相关性（r，P）

3 讨论

体液免疫是人体免疫系统的主要分支，主要通过浆细胞产生抗体发挥免疫保护作用机制，体液免疫紊乱是 RA发病的重要环节之一，致病因子侵入人体后，B细胞活化分泌大量抗体，抗体与抗原结合形成免疫复合物沉积于关节引起一系列免疫反应，引起组织损伤、滑膜增生及严重的破坏性关节炎[8]。B淋巴细胞是细胞共刺激分子，可通过促使机体产生针对自身抗原的抗体，引起多种免疫球蛋白升高[9]，还可激活补体系统，并引起补体成分的消耗[10]。现有研究显示免疫球蛋白升高的幅度与RA疾病的病程和严重程度有关[3]。

本研究结果表明RA患者血清DKK-1水平高于对照组，且DKK-1水平与RA疾病活动度有关，DKK-1是一种分泌型糖蛋白，由成熟成骨细胞和骨细胞分泌，DKK-1通过与受体LRP5/6结合阻断Wnt/β-catenin信号在细胞内传递，具有调节细胞增殖、分化、迁移、胚胎发育、器官发生和体内平衡等多种生物学功能[11]。DKK-1表达异常与多种疾病的发病和进展有关，包括恶性肿瘤发病、侵袭、转移[12]、动脉粥样硬化性脑血管疾病[13]、脊椎关节病[14]和类风湿关节炎[5]。DKK-1 作为Wnt/β-catenin通路的关键调控因子，通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路，破坏成骨-破骨系统稳定性，促使成骨细胞生成减少，破骨细胞生成增多，加速骨细胞凋亡和坏死进程[15]，由此可见DKK-1参与了RA骨侵蚀这一重要过程。但是DKK-1是否与RA体液免疫异常有关尚不得知，本研究发现RA患者血清IgG，IgA，IgM水平增高，补体C3，C4水平降低，DKK-1与IgG，IgA，IgM水平呈正相关，与补体C3，C4水平呈负相关，说明DKK-1参与RA体液免疫调节过程，DKK-1含量增加可能导致了免疫球蛋白增加，补体消耗。现有研究显示外周循环血中DKK-1主要来源于血小板，DKK-1含量增加可通过p38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和蛋白激酶1（SGK-1）激活辅助性T细胞2（Th2）及其细胞因子的产生，进而调节免疫炎性反应[16]。DKK-1在调节性T细胞（Treg）中也有丰富的表达，参与自身免疫性结肠炎的免疫耐受过程，有趣的是DKK-1在这一过程中受有丝分裂原激活的蛋白激酶途径调控，不受经典的Wnt/β-catenin途径调控[17]。众所周知，在免疫反应中，T细胞可释放淋巴因子刺激B细胞，B细胞作出免疫应答分化为浆细胞和记忆B细胞，介导产生抗体，发挥体液免疫作用，由此可见DKK-1可能间接参与体液免疫调节过程。

本研究结果表明RA患者血清CCL21水平明显增高，且CCL21水平随着RA活动度的增加而升高，说明CCL21参与RA发病和进展。CCL21定位于染色体 9p13，也称 TCA-4和 6Ckine，其受体是CCR7，CCR7在树突状细胞、胸腺细胞、B细胞和T细胞中表达，调控免疫细胞归巢，既维持适应性免疫系统的稳态，还可引起慢性炎性疾病[18]。CCL21与细胞膜表面上的受体CCR7结合，激活JNK 和p38MAPK等多种信号通路调节细胞生长、分化、凋亡和迁移过程，介导炎症反应和免疫损伤等病理过程[19]。现有研究显示CCL21/ CCR7轴不仅参与恶性肿瘤上皮间质转化、侵袭转移过程[20]，还参与软骨修复愈合过程[21]以及RA关节炎症和骨侵蚀过程[22]。本研究进一步相关分析发现CCL21与体液指标均存在相关性，说明CCL21具有调节RA体液免疫的作用。CCL21可通过活化T细胞，募集T细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞诱导关节炎症和骨侵蚀，并通过PI3K，ERK和JNK信号通路调节血管内皮生长因子表达，促使新生血管和血管翳形成，进而损伤骨关节，导致严重的疼痛、僵硬和活动障碍[23]。CCL21通过诱导M1细胞因子将幼稚T细胞分化为辅助性T细胞17（Th17），加速RA患者破骨细胞生成[24]。由此推测CCL21可能通过调控T细胞分化和细胞免疫功能，影响RA患者体液免疫系统。GPR174参与B细胞分化和活化，CCL21是GPR174的趋化受体，GPR174/ CCL21可正向调控B细胞迁移，诱导体液免疫[25]，可见CCL21可能通过GPR174/ CCL21途径直接影响RA患者体液免疫过程。

综上，RA患者血清DKK-1，CCL21水平均增高，DKK-1，CCL21水平与RA疾病活动度有关，DKK-1，CCL21可能直接或间接参与了RA患者体液免疫调控过程。本研究局限性在于尚不能直接证明DKK-1，CCL21在RA体液免疫调节的作用，其机制尚需进一步开展基础研究证实。