导流杂交法检测性传播疾病病原体核酸的临床应用价值分析

秦泽鸿，方炳雄*，陈汉强，方金萍，刘琪，蔡洁娜，张俊贤，翁文婕（普宁市人民医院：.检验科；.皮肤科；.药学部，广东 普宁 5500）

性疾病是长期以来危害人类健康的临床常见病，且部分性疾病具有高度传染性，致病微生物主要通过性接触感染，不仅严重损害患者健康并且给他人健康埋下安全隐患［1］。早期、快速、准确的检测与诊断对早期针对性的干预具有重要的意义，已被临床广泛重视，但现阶段，不同病原体的检测方法不同，流程较为繁琐，时间较长，性传播疾病(STD)病原体的检测方法有待进一步提高［2］。基因芯片导流杂交技术集多重PCR检测法、杂交法、基因芯片法于一身，实现一次取材多种病原体检测［3］，本研究采用导流杂交技术对2018年1月至2019年6月我院皮肤性病科收诊的1 077例疑似生殖道感染的男性患者进行检测，观察各类病原体的感染率，以为后期导流杂交法临床应用及更好的指导临床治疗提供参考。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1月至2019年6月我院收诊的疑似生殖道感染的男性患者1 077例，年龄22～68（46.68±9.52）岁。本研究经我院医学伦理委员会审核通过。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：（1）取得患者知情同意；（2）临床资料完整；（3）初诊；（4）精神状态正常。排除标准：（1）对研究存在异议；（2）恶病质；（3）严重慢性及基础疾病；（4）合并其他类型传染病；（5）中途退出或转院者。

1.3 方法

1.3.1 所有患者完善临床信息后均接受导流杂交法检测 嘱患者样本采集前2 h不能排尿，采用细小棉拭子伸入尿道2～4 cm并捻动收集患者尿道分泌物，2℃～8℃暂存送检。采用生殖道感染病原体核算检测试剂盒（PCR+导流杂交法）进行检测：（1）DNA提取：1.0 ml生理盐水漂洗拭子20 s，13 000 r/min离心5 min，弃上清，煮沸法提取DNA，-20℃备用。（2）PCR扩增：按照试剂盒操作说明，解冻后8 000 r/min离心5 min，配置反应体系50μl，扩增程序：先预变性：95℃，9 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃40 s共40 cycle；最后72℃5 min，16℃维持完成扩增。PCR产物经过热变性，成为单链DNA，用于与探针杂交。（3）导流杂交法：按照试剂盒说明书完成实验前准备和杂交前准备，完成后采用PCR产物50μl 95℃加热2 min，杂交孔内添加1 ml杂交液（45℃），温育至少2 min，弃杂交液，在PCR产物中加入0.5μl杂交液（45℃）混匀，加在薄膜中温育10 min开泵进行导流杂交，采用洗脱液（45℃）洗膜3次，每次0.8 ml，完成后关泵。完成后将杂交仪温度设定为25℃，0.5 ml封阻液封闭膜，排出后再加0.5 ml封阻液封闭5 min，排除封阻液，加0.5酶标液温育5 min，完成后将所有溶液排除，温度调整至36℃，配套溶液A液洗膜4次，0.8 ml/次，完成后加0.5 ml显色液，显色5 min，排除显色液另加杂交液洗膜3次，0.8 ml/次，完成后加2 ml蒸馏水漂洗，1 h内分析结果。阳性结果判定：阴性对照点无信号，病原体感染阳性点为蓝紫色圆点；病原体感染种类参照试剂盒说明中病原体对应位点。

1.3.2 解脲支原体和人型支原体的培养+药敏采用支原体鉴定、药敏试剂盒（微生物检验法）完成检测，相关操作严格按照试剂说明进行，UU利用尿素产碱，Mh利用精氨酸产碱的特性，能使得培养基中酚红发生由黄变红的颜色变化，判读是否有支原体感染［4］。选用临床常用于UU、Mh支原体治疗有效的12种抗生素，包括四环素(TET)、氧氟沙星(OFL)、红霉素(ERY)、强力霉素(DOX)、交沙霉素(JOS)、司帕沙星(SPA)、罗红霉素(ROX)、美满霉素(MIN)、左旋氧氟沙星(LEV)、克拉霉素(CLA)、阿奇霉素(AZL)、诺氟沙星(NOR)。选用高低两个浓度进行药敏试验，操作流程严格按照试剂盒说明进行，阳性判读：阳性为红色，阴性为黄色，敏感（S）：高低浓度均为黄色；中敏（I）：低浓度为红色，高浓度为黄色；耐药（R）：高低浓度均为红色［5］。

1.4 临床观察指标 （1）观察病原体的感染情况；（2）观察HPV与解脲支原体（UU）各亚型阳性检出率；（3）比较导流杂交法与培养法检测UU和人型支原体(Mh)阳性检出率；（4）观察UU、Mh的药敏培养结果。

1.5 统计学处理 数据采用SPSS 17.0统计学软件进行处理。计量资料采用±s表示，行t检验；计数资料采用例（百分率）表示，行χ2检验。P<0.05示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 导流杂交法检测病原体的感染情况 结果显示，1077例中阳性606例，感染率为56.27%（606/1 077）；单一病原体感染：447例；两种病原体感染：132例；三种病原体感染：24例；四种病原体感染：3例。其中HPV：402例；NG：104例；CT：67例；UU：148例；Mh：39例；Mg：15例；HSV II：20例。见图1。

图1 606例阳性患者病原体感染种类及分布示意图

2.2 导流杂交法检测HPV及UU分型结果分析 结果显示，HPV阳性402例，感染率为37.33%（402/1 077），检出率前六位的HPV亚型分别为6亚型（16.16%）、11亚型（9.66%）、16亚型（4.83%）、52亚型（4.64%）、18亚型（2.97%）和51亚型（2.97%），见表1和图2。UU阳性148例，感染率为13.74%(148/1 077)，其中Uuu：68例（6.31%）；Uup1:13例（1.21%）；Uup3:57例（5.29%）；Uup6：8例（0.74%）；Uup14:2例（0.19%）。

图2 1 077例男性HPV各亚型阳性检出率分布

表1 1 077例男性HPV各亚型阳性检出率

2.3 导流杂交法与培养法检测UU、Mh阳性结果分析 结果显示，导流杂交法与培养法检测UU阳性例数分别为148例和132例(13.74%VS 12.26%，χ2=1.051，P=0.305)；Mh阳性例数分别为39例和27例(3.62%VS 2.51%，χ2=2.251，P=0.134)。导流杂交法检测UU的灵敏度、特异性和符合度分别为99.24%、98.20%和98.33%，检测Mh的灵敏度、特异性和符合度分别为92.59%、98.67%和98.51%。见表2。

表2 导流杂交法检测UU、Mh的应用价值

2.4 不同UU、Mh表达患者药敏培养结果分析 培养法检测UU、Mh阳性分别为132例和27例，两者同时阳性22例，药敏结果显示，UU、Mh均阳性者耐药前五位分别为NOR、AZL、TET、JOS、LEV，耐药率分别为77.27%（17/22）、68.18%（15/22）、63.64%（14/22）、54.55%（12/22）、50.00%（11/22），以ERY、DOX、ROX最为敏感，依次为ROX>DOX>ERY，但DOX无耐药病例。UU阳性而Mh阴性者耐药前五位分别为NOR、OFL、AZL、TET、SPA，耐药率分别为60.00%（66/110）、49.09%（54/110）、45.45%（50/110）、40.91%（45/110）、36.36%（40/110），以DOX最为敏感。UU阴性而Mh阳性者以TET、OFL、AZL耐药性最高，耐药率均为80%，JOS、MIN、NOR次之，耐药率均为60%，以DOX最为敏感。见表3。

表3 137例支原体阳性药敏结果

3 讨论

现阶段，随着国民思想不断开放，人们对性的关注度不断提升，但由于STD病原体较多，且相关疾病认知、预防等知识普及度相对低下，导致近年来我国STD感染情况日趋严重，不仅影响患者及他人身体和心理健康，甚至影响下一代的健康［6］。在积极推广STD相关疾病健康知识教育的同时，快速、有效的检测和早期针对性的抗生素治疗是改善患者预后状态的关键［7］。目前，不同STD病原体以及不同性别患者检测方法有所差异，在考虑合并多种病原体感染时，往往需要重复多次取材进行分别检测，不仅增加了工作量，并且增加了患者的经济负担［8］，故STD病原体检测方法仍有待提高。

此外，本研究采用培养法对导流杂交法检测的UU及Mh阳性病例进行分析，结果显示，导流杂交法与培养法检测UU阳性例数分别为148例和132例(13.74%VS 12.26%，χ2=1.051，P=0.305)；Mh阳性例数分别为39例和27例(3.62%VS 2.51%，χ2=2.251，P=0.134)。导流杂交法检测UU的灵敏度、特异性和符合度分别为99.24%、98.20%和98.33%，检测Mh的灵敏度、特异性和符合度分别为92.59%、98.67%和98.51%。提示导流杂交法与培养法具有相当的检测效能，且较培养法更加快速、便捷。本研究培养法检测UU、Mh阳性者分别为132例和27例，两者同时阳性22例，药敏结果显示，UU、Mh均阳性者以耐诺氟沙星、阿奇霉素、四环素、交沙霉素、左旋氧氟沙星最为常见，以红霉素、强力霉素、罗红霉素治疗最为敏感，且强力霉素无耐药病例。UU阳性而Mh阴性者以耐诺氟沙星、氧氟沙星、阿奇霉素、四环素、司帕沙星最为常见，以强力霉素治疗最为敏感。UU阴性而Mh阳性者以耐四环素、氧氟沙星、阿奇霉素最常见，以强力霉素治疗最为敏感。

综上所述，导流杂交法在STD病原体检测和分型中作用明显，能够准确的检测STD病原体类型及各亚型，采用药敏试验指导临床用药具有重要的意义。