稀土矿区不同土地利用类型土壤细菌群落特征及网络分析

杨贤房 ，陈朝 ，郑林，万智巍，陈永林，王远东

1.江西师范大学地理与环境学院，江西 南昌 330022；2.广东省科学院生态环境与土壤研究所/广东省农业环境综合治理重点实验室，广东 广州 510650；3.华南土壤污染控制与修复国家地方联合工程研究中心，广东 广州 510650；4.赣南师范大学地理与环境工程学院，江西 赣州 341000

细菌群落结构对植被变化十分敏感（Ji et al.，2020），植被通过影响土壤分泌物、温度、水分、化学性质等影响细菌群落构建，同时特定功能细菌在植物根系中富集（Liu et al.，2020），对于土壤养分具有重要的指示作用（Creamer et al.，2016）。不同土地利用方式影响土壤的植被类型和理化性质，尤其在矿区周边不同土地利用类型中，土壤植物类型不同，过度开采等人类活动所导致的环境变化，从根本上改变了土壤质量和养分循环，从而构建新的土壤微生物群（Mganga et al.，2016）。当前矿区不同土地利用类型微生物相关研究多集中在铅锌矿区（于方明等，2020）、铜矿区（黄健等，2019）等，而离子型稀土矿区周边土地利用方式对细菌群落影响的研究较少。稀土矿山在长期开采、选冶等过程中造成了植被破坏，导致重金属离子进入周边土壤中，对周围居民健康构成严重威胁（Romero-Freire et al.，2018；Wang et al.，2020），现有稀土矿区土壤环境问题治理研究多关注植被修复，研究表明，稀土开采对土壤细菌多样性造成了显著变化（王友生等，2017），不同植被修复模式下土壤质量存在明显差异性（周彩云等，2019）,土壤修复后细菌多样性有明显的提高（陈熙等，2016），但植被恢复4年以后，土壤理化性质呈下降趋势，细菌多样性开始降低（李启艳等，2019）。总体而言，已有研究多关注植被修复措施下土壤细菌群落的变化，而对矿区不同土地利用类型细菌群落特征及物种互作研究不多。当前，赣南离子型稀土矿区修复措施已由原来的单一植被修复发展为植被、果园、蔬菜等多种不同模式，基于此背景，了解稀土矿区内不同土地利用类型的细菌多样性及群落结构差异，进而探索矿区土壤生态修复机理这一工作成为必要。此外，共现网络常用来表达微生物的相互共存和排斥关系，并识别影响土壤功能的关键微生物（Banerjee et al.，2018），其中一些营养菌和植物病原菌等关键微生物类群影响着植物生长（Fan et al.，2020），对于土壤修复发挥着重要作用，共现网络分析在稀土矿区生态修复中的应用，将为探究该过程中细菌生态功能提供重要帮助。

残留在稀土矿区土壤中的SO42－和NH4+，随着降雨、灌溉不断向周边扩散，导致水体铵态氮超标（师艳丽等，2020），土壤生态环境受到破坏。基于此，本研究运用高通量测序和网络分析技术，分析矿区不同生境细菌多样性及群落特征，目的在于：（1）分析稀土矿区不同土地利用类型理化性质、重金属含量，探索细菌群落特征及其影响因素；（2）探究土壤中同铵态氮、硝态氮、硫酸盐等相关的功能细菌，研究结果可为离子型稀土矿区生态修复提供重要信息。

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

样品采集区为江西省龙南市足洞稀土矿区，年平均气温18.9 ℃，年降水量1526.3 mm，年蒸发量1064.2 mm，主要植被类型有百喜草、香根草、铁线蕨和马尾松等，取样于2021年6月中旬进行，天气晴朗，气温 33 ℃。裸地为矿区未修复地，以裸地为对照组，在矿区植被恢复区水稻田、草地、玉米地、蔬菜、果园、林地选取植物根际5—20 cm土层进行采集，每个采样点分别取土5份，并将其混合均匀，合成一个样品，每个土地类型设置一定数量的重复样，其中水稻田3个、蔬菜地3个、果园3个、玉米地3个、林地3个，草地9个（包括铁线蕨、百喜草、香根草）。此外，为了更好的提升裸地样品的代表性，分别沿山地坡中、坡脚、尾水库旁采样，共采集土壤样品14个(坡中3个、坡脚3个、沿尾水库8个)，所有样品共计38个。将采集样品分为2份，并经保温处理后，一份送往深圳微科盟科技有限公司，另一份送往实验室测定理化性质。

1.2 土壤理化性质测定

采用电位法测定土壤 pH值（土꞉水质量比=1꞉2.5）；用重铬酸钾容量法外加热法测定有机质（OM）；全氮（TN）采用半微量凯氏定氮法测定；全磷（TP）采用NaOH熔融-钼锑抗比色法测定；有效磷用0.5 mol·L−1NaHCO3浸提，钼锑抗比色法测定；土壤硝态氮（NO2-N）和铵态氮（NH3-N）分别采用KCl浸提-紫外分光光度法和KCl浸提-靛酚蓝比色法。上述测定具体方法参见《土壤农化分析》（鲍士旦，2000）。重金属测试参考《土壤和沉积物王水提取金属元素-电感耦合等离子体质谱法》（HJ 803—2016，中华人民共和国环境保护部，2016），测定8种重金属元素（Cd、As、Cu、Pb、Cr、Ni、Zn、Mn）含量，采用内梅罗综合污染指数评价重金属污染情况。

式中：

PN——内梅罗综合污染指数；

Ci——重金属i的实测值；

Si——重金属i的当地背景值。

1.3 土壤样品DNA提取和测序

按照Omega Bio-tek，Norcross公司E.Z.N.A.®soil DNA Kit试剂盒操作方法提取 DNA，对 16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增，扩增引物序列为338F和806R。将同一样品的PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用 AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。参照电泳初步定量结果，将PCR扩增产物经建库检测，将合格的文库在IlluminaMiSeq（PE300）上进行测序。

1.4 细菌网络构建及数据处理

基于属水平测序结果，保留相对丰度占比>0.01%且在>20%样本中出现的物种，参考相关文献设置Spearman相关系数r≥0.6，显著性P<0.05的阈值（Liu et al.，2020），构建耕地、植被、裸地3种土壤细菌网络，利用Gephi软件对网络进行可视化。利用Pearson相关系数来确定土壤性质与细菌之间的关联，通过冗余分析（RDA）研究理化性质对细菌群落结构的影响，通过火山图分析不同土地利用类型间物种显著性差异。

2 结果分析

2.1 土壤理化性质及重金属含量

本研究中，不同土地利用类型土壤pH均为酸性，裸地的pH、全氮、有机质、全磷为所有用地最低，水稻田、果园、蔬菜地、玉米地全氮、有机质、全磷含量高于其他用地。林地、草地、裸地有效磷含量忽略不计（表1），水稻田、蔬菜地铵态氮含量大幅高于林地、草地，裸地、蔬菜地硝态氮含量高于水稻田、玉米地、果园等。不同土地利用类型均出现一定程度的重金属污染现象，内梅罗综合污染指数排序为草地 (4.75)>林地 (4.35)>果园(2.08)>水稻田 (1.71)>裸地 (1.61)>蔬菜地 (1.60)>玉米地 (1.57)。其中林地 Pb含量最高，为 191.11 mg·kg−1，是江西省背景值的5.95倍，其次为草地。草地Cd、As含量最高，Cd含量为背景值的6.3倍，As含量为背景值的5.04倍。蔬菜地Pb、Mn、Cd含量分别为背景值的2、1.7、1.4倍，水稻田Pb、Zn含量分别为背景值的2.26、1.24倍，玉米地Zn、Mn含量为背景值的1.42倍，Cu、Cr、Ni含量无超背景值，以上分析结果表明，不同土地利用类型土壤理化性质存在一定的差异。

表1 不同土地利用类型土壤理化性质分析Table 1 Analysis of soil physico-chemical properties of different land use types

2.2 细菌群落组成

不同土地利用类型细菌多样性及群落结构差异较大（表2），其中Chao1指数排序为玉米地>蔬菜地>水稻田>果园>草地>林地>裸地，Shannon指数排序为玉米地>水稻田>蔬菜地>林地>果园>草地>裸地。优势菌门为变形菌门（Proteobacteria，25.4%—87.7%）、酸杆菌门（Acidobacteria，4%—43.3%）、放线菌门（Actinobacteria，3.1%—13.1%）。裸地 Proteobacteria比例最高（87.7%），其次为Actinobacteria、绿弯菌门（Chloroflexi），果园Acidobacteria占比最高（43.3%）。此外，在水稻田、果园、林地土壤 Chloroflexi占比分别为 8.7%、11.1%、6.7%，在蔬菜地、草地、玉米地拟杆菌门（Bacteroidetes）占比分别为10%、9.2%、6.2%。在属水平上，较丰富的物种包括劳尔氏菌属（Ralstonia）、产黄杆菌属（Rhodanobacter）等，其中裸地Ralstonia丰度为10.1%，是裸地土壤主要菌属，伯克霍尔德菌（Burkholderia）为裸地、果园、林地土壤优势菌属（大于1%），地杆菌（Geobacter）为玉米地、水稻田土壤优势菌属，硝化螺菌属（Nitrospira）为蔬菜地土壤优势菌属（图1）。

图1 不同土地利用类型土壤细菌群落组成Figure 1 Abundance of the bacterial community in soil under different land use types

表2 不同土地利用类型土壤细菌多样性分析Table 2 Analysis of soil bacterial diversity in different land use types

由裸地、植被、耕地类土壤细菌丰度显著差异比较分析可知（图2），图左侧为丰度显著下降物种，右侧为显著上升物种，相对裸地，植被、耕地类土壤Ralstonia丰度下降，Bradyrhizobium、Rhodanobacter、Kaistobacter丰度显著上升。相较植被类土壤，耕地Ralstonia丰度显著性下降，硫杆菌属（Thiobacillus）、脱硫球茎菌属（Desulfobulbus）、披毛菌属（Gallionella）丰度显著上升，其中草地和蔬菜地Rhodanobacter丰度分别为1.4%、2.0%，水稻田Thiobacillus丰度为1.6%、Desulfobulbus丰度为0.9%。

图2 裸地、植被、耕地土壤细菌显著性差异火山图Figure 2 Bacterial volcanic map of bare land, vegetation and cultivated soil

2.3 细菌群落互作关系

基于裸地、植被（林地、草地）、耕地（蔬菜地、水稻田、果园、玉米地）测序结果构建生态网络（表3、图3）。结果显示，植被、耕地类土壤细菌分子网络平均连通度大于裸地，模块数小于裸地，表明随着土壤植物恢复，其网络规模、复杂性均得到了提升，其中耕地节点数、连通度大于植被用地。相关性正负比例可以反映物种间共生或竞争捕食关系，3类用地细菌作用均以正相关为主，显示不同土地利用类型细菌均以合作关系为主，其中负相关比例排序为耕地>植被>裸地。路径长度可以反映物种间传递物质、能量效率高低，裸地路径长度最大，耕地最小，表明耕地、植被分子网络能量传递效率上升，细菌互作网络对外界环境更为敏感。

图3 不同土地利用类型细菌群落共现网络Figure 3 Co-occurrence network of bacterial community under different land use

表3 生态网络特征参数Table 3 Characteristic parameters of the molecular ecological network

2.4 环境因子与细菌群落结构、多样性相关性

通过 RDA分析了环境因子与细菌群落结构、多样性相关性。在门水平上，土壤pH及土壤营养物质共解释了细菌群落结构变化的73%，重金属共解释群落结构变化的61.72%。Ni、Cu、Pb是与细菌群落结构关联性最大的重金属因子，其中全氮、pH、Ni、Cu 同 Nitrospirae、疣微菌门（Verrucomicrobia）正相关，同 Acidobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria负相关。

在属水平上，全氮、pH同Bradyrhizobium负相关，铵态氮、硝态氮同Rhodanobacter正相关，Ni、Cu同Rhodoplanes、Geobacter正相关（图4、5）。土壤理化性质与细菌多样性相关性结果显示（表4），Ni、Cu、pH、全氮、有机质是与矿区土壤细菌多样性关联性最大的重要因子，与 OTUs数、Ace指数、Shannon指数、Chao1指数呈显著以上正相关。

表4 土壤细菌多样性与理化性质、重金属含量相关性分析Table 4 Correlation Analysis of soil bacterial diversity with physico-chemical properties and heavy metal content

图4 土壤理化参数与物种的非冗余分析（redundancy analysis，RDA）分析Figure 4 RDA of soil physico-chemical properties and species

图5 重金属含量与物种的非冗余分析（redundancy analysis，RDA）分析Figure 5 RDA analysis of heavy metal content and species

3 讨论

3.1 稀土矿区土壤理化性质特征、重金属与细菌多样性相关性

不同生境土壤由于稀土开采、植被覆盖、经营管理措施等不同，可能导致土壤理化性质存在差异。从土壤pH看，矿区不同土地利用类型土壤pH均呈酸性，裸地、草地、林地等土壤pH低于其他用地，这可能是土壤中残留浸矿剂向周边土壤扩散，导致了土壤酸化，因林地、草地等样地距离稀土开采点更近，所以其土壤酸化程度更高。从土壤营养物质含量看，蔬菜地、水稻田由于施肥等经营措施，全氮、全磷、铵态氮等含量高于其他用地，林地、草地、裸地土壤全磷、有效磷含量明显低于其他用地类型，李启艳等（2019）对福建长汀离子型稀土矿区土壤研究也得出类似结论，有相关研究表明，土壤 pH值同有效磷含量显著正相关（陈朝阳，2011），推测龙南稀土矿区土壤有效磷含量低同土壤酸化存在一定的关系。从土壤重金属含量来看，矿区土壤存在重金属Pb、Cd、As、Mn、Zn超过江西省背景值现象，刘胜洪等（2014）对广东省河源市稀土矿区土壤重金属开展了相关研究，发现Mn、Pb、Zn超过当地背景，相较河源稀土矿区，龙南稀土矿区还存在Cd、As污染，其中裸地、草地、林地、蔬菜地Cd均存在不同程度污染。通常情况下，重金属污染受距矿区空间距离、重金属高背景值、植物类型、土壤营养物质等多方面影响，本研究中，草地、林地土壤样品距离采矿点位置较近，受重金属迁移和活化影响更大，可能导致其重金属污染程度高于其他用地。与此同时，有研究表明龙南稀土矿区表层土壤具有重金属高背景值特点（任仲宇等，2016），这可能是导致稀土矿区重金属污染存在差异的重要原因。从重金属与细菌多样性相关性看，土壤 Pb含量与细菌多样性关系并不显著，王继玥等（2018）发现，轻度Pb污染对三叶草根际土壤细菌多样性影响不显著。Cu含量与细菌丰度显著性正相关，李大乐等（2021）研究铜浓度与细菌多样性关系发现，当Cu浓度≤100 mg·kg−1时，随着铜浓度增加细菌群落丰度和多样性增加。矿区土壤Ni含量同细菌多样性极显著正相关，微量的 Ni能促进土壤微生物活动（王丙烁等，2018）。总体而言，由于龙南稀土矿区土壤重金属多为轻度污染，重金属污染并未对土壤细菌多样性丧失造成显著影响。

3.2 稀土矿区土壤细菌多样性、群落结构差异及其影响因素分析

不同土地利用类型土壤细菌多样性和群落结构均存在一定的差异。从土壤细菌多样性方面来看，Chao1指数排序为耕地>植被>裸地，这同已有的研究结果存在一定的差异，张旭博等（2020）研究农业土地利用方式对土壤微生物群落特征的影响发现，植被土壤细菌多样性高于耕地，原因可能有以下几点，一方面，本研究相关性分析结果显示，pH与土壤细菌多样性相关系数最大，草地、林地土壤pH约为4.5，且低于耕地土壤pH，这可能导致了耕地土壤细菌多样性高于植被；另一方面，耕地全氮等含量均高于植被土壤，相关性分析显示，全氮、有机质等与土壤细菌多样性显著正相关。从土壤细菌群落结构方面看，Ralstonia在裸地土壤中丰度相对较高，而在植被和耕地土壤中丰度显著下降，该细菌是典型的植物病原菌，此前有研究发现，土壤磷含量较低会降低植物对病菌的抵御能力，导致植物病菌的丰度提升（杨尚东等，2013）。此外，从不同土地利用类型土壤细菌群落结构比较来看，相较裸地对照组，植被、耕地类土壤中Bradyrhizobium、Rhodanobacter、Kaistobacter、Rhodoplanes、CandidatusSolibacter菌属丰度均显著提升，综观相关文献报道，这些细菌主要为植物促生、脱氮功能细菌，其中Bradyrhizobium为重要的固氮菌属，能够促进植物生长，且具备反硝化功能，Rhodanobacter为对低pH值、高硝酸盐、重金属具有耐受性的反硝化菌属，Candidatussolibacter为能分解有机质、利用碳源的植物促生功能菌（Rime et al.，2015）。由上可知，植被和耕地恢复措施均能提升矿区土壤促生和反硝化功能优势细菌的多样性，改变土壤细菌群落结构，土壤促生和反硝化功能优势细菌的多样性增加，可对稀土矿区土壤生态修复起到一定程度的促进作用。

相较植被土壤细菌，耕地土壤Thiobacillus、Nitrospira、Desulfobulbus、Gallionella等硫循环功能微生物丰富度增加，其中Thiobacillus能将硫化物氧化成单质硫（Tang et al.，2009），Desulfobulbus是能使硫酸盐化合物还原成硫化氢的常见菌（Hao et al.，2014）。稀土矿区原地浸矿反应完成后，大量 SO42－仍留存矿体中，随地表径流排入周边河湖水体、土壤，形成硫酸盐化合物。经实测，本研究水稻田土壤 SO42－含量约为 250—300 mg·kg−1，矿区尾水库两侧裸地 SO42－含量高达 3000 mg·kg−1，耕地土壤硫氧化还原功能优势菌属多样性更高，表明耕地修复措施具有更好促使硫循环的潜能。通常情况下，硫循环功能微生物多样性主要受温度、pH、海拔、有机质等多方面因素影响，该类功能细菌在中性条件或弱碱性条件下生长良好且能高效进行硫循环功能（Wang et al.，2011），pH偏酸性时，部分嗜碱菌株生长受到抑制。此外，有机质组分特征也是影响硫循环功能细菌群落差异的重要因素（陈俊松等，2020），总体而言，耕地土壤硫氧化还原功能优势菌属的识别，对于稀土矿区土壤修复提供了重要信息。

土壤微生物之间以复杂的网络共存或拮抗，不同土地利用类型物种共现网络不同。本研究中，相较裸地土壤细菌共现网络，植被、耕地类土壤细菌网络规模增加，网络路径长度减小。这可能是由于蔬菜、玉米等耕地氮、磷养分输入，土壤营养物质含量增加，促进了富营养细菌繁殖，网络规模增大。李冰等（2020）研究发现，旱地、水田土壤的网络规模要高于林地、城市绿地，重度富营养湖泊中分子网络规模要高于中度湖泊（陈光哲等，2020），可见营养物质是影响物种共现网络规模的重要因素。此外，耕地土壤细菌共现网络负相关比例高于植被、裸地，相关研究表明，在资源相对贫乏的区域，细菌更易增加合作来分解、合成难以利用的物质（Iliopoulos et al.，2008），林地、草地等植被土壤有效磷、全磷含量较低，这可能是影响矿区细菌共现网络负相关比例的重要因素。总体上，本研究通过分析不同土地利用类型的土壤细菌群落结构差异，识别了裸地、植被、耕地土壤的功能细菌，今后研究中应加强不同植被修复方式下酸性土壤解磷、硝化、硫氧化还原功能细菌研究，以其为稀土矿区生态治理提供参考。

4 结论

本研究分析了赣州市龙南稀土矿区不同土地利用类型土壤营养物质、重金属含量特征，并利用高通量测序技术分析了土壤细菌多样性及群落结构。研究发现，稀土矿区不同土地利用类型土壤pH值均呈酸性，裸地、林地、草地等有效磷含量较低，不同土地利用类型土壤Cd、Pb、As、Mn、Zn等重金属含量超过背景值，内梅罗综合污染指数排序为草地>林地>果园>水稻田>裸地>蔬菜地>玉米地。相较裸地，植被、耕地类土壤Ralstonia丰度显著下降，Rhodanobacter、Bradyrhizobium和Kaistobacter等细菌丰度显著上升。耕地土壤中Thiobacillus、Desulfobulbus、Gallionella等细菌相较植被土壤丰度更高，植被、耕地种植措施增加了土壤细菌网络规模，减少了网络路径长度。铵态氮、全氮、有机质、pH、Cu、Ni等是影响矿区土壤细菌群落结构变化的主要因素，重金属污染并未对矿区土壤细菌多样性丧失造成明显的影响。研究表明，相较裸地对照组，植被和耕地恢复措施均能提升矿区土壤促生和反硝化功能优势类细菌多样性。耕地土壤中硫循环功能优势类细菌较植被土壤多样性更高，不同土地利用类型土壤功能细菌的识别能对稀土矿区生态修复提供科学指引。