高效液相色谱-串联质谱法同时测定尿液中12种邻苯二甲酸酯类代谢物的含量

2022-06-24石飞云徐梦媛唐宏兵欧阳运富黎俊宏

理化检验-化学分册 2022年6期

石飞云,徐梦媛,靳艺,唐宏兵,欧阳运富,黎俊宏

(常州市疾病预防控制中心,常州 213022)

增塑剂邻苯二甲酸酯类化合物(PAEs)是工业上被广泛使用的高分子材料助剂,在玩具、壁纸、食品包装材料、地板、化妆品、医疗器具以及胶黏剂等行业中应用广泛[1],在塑料加工中添加PAEs可以增强塑料的柔韧性、容易加工。在塑料制品中,PAEs一旦遇到所包装物质如水、油脂等时很容易溶出,而且经过长时间作用,会从塑料中溢出,对周围环境如食品、土壤、空气、水等造成污染。PAEs在环境中很难被降解,已经成为一种常见的环境污染物[2-4]。有研究资料表明,PAEs在人体内停留一段时间才会排出,长期会造成免疫力及生殖力下降。因此,很多国家将PAEs 列为优先监测的污染物[5-9]。

PAEs进入人体后迅速代谢为相应的单酯,如短链的PAEs经酯水解为单酯排泄到尿液;长链的PAEs被简单地水解后,经烷基侧链氧化形成单酯的氧化产物。单酯和单酯的氧化产物可经生物转化与葡萄糖醛酸结合,大部分结合的和未结合的代谢物从尿中排出。因此,尿中代谢产物的含量能够间接反映个体PAEs的摄入量[10-12]。目前,国内外关于PAEs的检测研究比较多,而对于PAEs代谢物的分析研究相对较少。国内外人体尿液中PAEs代谢物基本都是采用固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法检测[11]。

本工作在尿液酶解后直接用乙腈定容,冷冻除去杂质后过膜上样,省去了固相萃取的繁琐操作,采用高效液相色谱-串联质谱法同时测定邻苯二甲酸单甲酯(MMP)、邻苯二甲酸单乙酯(MEP)、邻苯二甲酸单异丁酯(MIBP)、邻苯二甲酸单(2-乙基-5-羟己基)酯(MEHHP)、邻苯二甲酸单正丁酯(MNBP)、邻苯二甲酸单(2-乙基-5-氧己基)酯(MEOHP)、邻苯二甲酸单苄酯(MBZP)、邻苯二甲酸单环己酯(MCHP)、邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(MEHP)、邻苯二甲酸单正辛酯(MOP)、邻苯二甲酸单异壬酯(MNP)、邻苯二甲酸单异癸酯(MDP)等12种PAEs代谢物的含量,并进行了方法学验证,其精密度和回收率均符合要求。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

岛津LCMS-8060型高效液相色谱-三重四极杆质谱仪;Multi Reax多点涡旋振荡器。

单标准储备溶液:100 mg·L－1,准确称取各标准品0.001 0 g,分别用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成100 mg·L－1的单标准储备溶液,于4 ℃保存。

混合标准溶液:分别移取MMP、MEP、MCHP、MBZP、MEOHP、MEHHP、MEHP、MOP、MNP、MDP标准储备溶液1.0 mL,MIBP 标准储备溶液2.0 mL,MNBP标准储备溶液3.0 mL,用甲醇定容至100 mL,配制成MMP、MEP、MCHP、MBZP、MEOHP、MEHHP、MEHP、MOP、MNP、MDP 的质量浓度均为1 mg·L－1,MIBP 的质量浓度为2 mg·L－1,MNBP的质量浓度为3 mg·L－1的混合标准溶液,于4 ℃保存待用[13]。

单内标储备溶液:100 mg·L－1,称取各内标标准品0.001 0 g,分别用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成质量浓度为100 mg·L－1的单内标储备溶液。

混合内标溶液:4 mg·L－1,分别取单内标储备溶液各1 mL,用甲醇定容至25 mL,配制成质量浓度均为4 mg·L－1的混合内标溶液,于4 ℃保存待用。

12种PAEs代谢物及其内标的标准品纯度均不小于95%;β-葡萄糖醛酸酶溶液,85 000 U·m L－1;甲醇、乙腈均为色谱纯;试验用水为高纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Waters 苯基色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);流量0.3 mL·min－1;进样量5μL;柱温40 ℃;流动相A 为0.1%(体积分数)乙酸溶液,B为乙腈;梯度洗脱程序:0～2.0 min 时,A 为95%;2.0～4.0 min时,A 由95%降至40%;4.0～6.0 min时,A 由40%降至10%,保持2.0 min;8.0～8.5 min时,A 由10%升至95%,保持1.5 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源,负离子模式;碰撞气为氩气;雾化气流量3 L·min－1;加热气流量10 L·min－1;干燥气流量10 L·min－1;接口温度300℃;脱溶剂温度526℃;脱溶剂管温度250℃;加热块温度400 ℃。

其他质谱参数见表1。其中“∗”代表定量离子。

表1 (续)

1.3 试验方法

移取2 mL尿液,置于5 mL 聚乙烯管中,加入4 mg·L－1混合内标溶液0.01 mL、不低于850 U·m L－1的β-葡萄糖醛酸酶溶液和1 mol·L－1乙酸铵溶液0.5 mL,充分振荡。于37 ℃水浴条件下水解2.0 h,取出降至室温[14],用乙腈定容至5 mL,涡旋混匀,冷冻2 h,取出恢复至常温后,过0.22μm 有机滤膜,滤液按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按照仪器工作条件测定含100μg·L－112种PAEs代谢物和8μg·L－1内标的混合标准溶液,所得色谱图见图1。

图1 色谱图Fig.1 Chromatogram

2.2 水解时间的选择

以低、中浓度水平的阳性样品为研究对象,固定水解温度为37 ℃,试验考察了水解时间对12 种PAEs代谢物(以MIBP 计)测定结果的影响,结果见表2。

表2 水解时间对MIBP测定结果的影响Tab.2 Effect of hydrolysis time on determination results of MIBP

结果表明:水解时间为1.0 h时,MIBP 测定值较低,说明水解不完全;水解时间为2.0,3.0,4.0 h时,虽MIBP测定值仍在增高,但变化不大,说明在2.0 h时基本水解完全。考虑到试验成本及分析效率,试验选择水解时间为2.0 h。

2.3 基质效应

在目标物和内标中加入非生物基质的空白溶液(甲醇),配制成低、中、高浓度水平的空白溶剂加标溶液系列;按照试验方法处理空白样品基质,并加入目标物和内标,配制成低、中、高浓度水平的空白基质加标溶液系列。按照仪器工作条件测定上述溶液系列,获得12种PAEs代谢物和相应内标的信号强度,计算目标物和相应内标的基质效应因子(MF＝空白基质加标溶液中的峰面积/空白溶剂加标溶液中的峰面积),结果见表3。当MF 小于0.85时,存在基质抑制效应;当MF 为0.85～1.15时,基质效应不明显;当MF大于1.15时,存在基质增强效应。

表3 基质效应Tab.3 Matrix effect

由表3可知:MMP、MEP及其相应内标的MF为0.28～0.50,说明存在严重的基质抑制效应;MDP、MOP、MNP、MEHP及其相应内标在浓度水平较低和较高时都存在基质增强效应;MEHHP在50.0μg·L－1浓度水平下的MF 为0.83,存在较弱的基质抑制效应;其余目标物及其相应内标的MF均在0.85～1.15内,基质效应不明显。鉴于此,试验采用基质匹配法消除基质干扰。

2.4 工作曲线、检出限和测定下限

分别移取2 mL空白尿液置于一组5 mL 离心管中,加入适量混合标准溶液和4 mg·L－1的混合内标溶液0.01 mL,向各离心管中加入不低于850 U·m L－1的β-葡萄糖醛酸酶溶液和1 mol·L－1乙酸铵溶液0.5 mL[15],配制成12 种PAEs代谢物质量浓度分别为1.00,5.00,10.0,20.0,50.0,100,200μg·L－1,内标质量浓度为8μg·L－1的基质匹配的混合标准溶液系列。按照仪器工作条件测定,以目标物的质量浓度为横坐标,以目标物峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标绘制工作曲线,内标法定量。结果表明,12种PAEs代谢物工作曲线的线性范围均为1.00～200μg·L－1,其线性回归方程和相关系数见表4。

以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),以3倍检出限计算测定下限,结果见表4。