超高效液相色谱-电化学检测法测定饮料中爱德万甜和5种二氢查耳酮类甜味剂的含量

淳泽利 ,谷莹莹 ,陈荣祥∗

(1.遵义医科大学 生命科学研究院,遵义 563000;2.遵义医科大学 遵义市理化分析测试工程技术研究中心,遵义 563000;3.遵义医科大学 公共卫生学院,遵义 563000)

甜味剂作为食品添加剂,调节着饮料的风味。爱德万甜作为一种新型的高甜度甜味剂[1],由阿斯巴甜和香兰素通过化学反应合成而得,其分子式为C24H30N2O7·H2O。通过国家卫生和计划生育委员会发布的2017年第8号公告可知,爱德万甜作为新品种的食品添加剂被允许加入到饮料中,其限量值为0.003 g·kg－1[2-3]。以新橙皮苷二氢查耳酮为代表的二氢查耳酮类甜味剂是一类天然甜味剂,常用于食品生产。

目前,关于爱德万甜和二氢查耳酮类甜味剂检测方法的报道均较少。爱德万甜的测定方法有高效液相色谱-二极管阵列检测法(HPLC-DAD)[1,4]、高效液相色谱-荧光检测法[5]、液相色谱-质谱联用法[3,6-9];二氢查耳酮类甜味剂的测定方法有毛细管电泳法[10]、高效液相色谱法[11-15]、液相色谱-质谱联用法[16-18]等。由于爱德万甜的甜度较高,其添加量相对其他的甜味剂较低,因此需要更为灵敏的检测方法。爱德万甜、根皮苷、柚皮苷二氢查耳酮、三叶苷、新橙皮苷二氢查耳酮和根皮素均为酚类物质,容易被氧化,而电化学检测器(ECD)灵敏度极高,可达fmol水平,且该检测器对容易被氧化的物质有着特异的选择性,其在药品和食品质量控制方面发挥着重要的作用[19-20]。目前并没有同时测定上述6种甜味剂的文献报道,本工作提出了超高效液相色谱-电化学检测法(UHPLC-ECD)测定爱德万甜和5种二氢查耳酮类甜味剂含量的方法。一方面,利用超高效液相色谱可以缩短分离时间,提高分析效率;另一方面,利用ECD 的高灵敏性,可降低检出限,为饮料中甜味剂的快速测定提供参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

U3000型超高效液相色谱仪,配有3000 RS型ECD、3400RS型二极管阵列检测器(DAD)及变色龙7.1工作站;Legend Micro 17台式微型离心机;Purelab Chorus型超纯水系统;BSA124S-CW 型分析天平。

单对照品储备溶液:精密称取根皮苷、柚皮苷二氢查耳酮、三叶苷、新橙皮苷二氢查耳酮、爱德万甜、根皮素标准品适量,加甲醇溶解,并转移至10 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成根皮苷、柚皮苷二氢查耳酮、三叶苷、新橙皮苷二氢查耳酮、根皮素质量浓度均为2.500 g·L－1,爱德万甜质量浓度为1.000 g·L－1的单对照品储备溶液,于4 ℃冰箱冷藏备用。

混合对照品溶液:移取适量的单对照品储备溶液置于10 mL 容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成根皮苷、柚皮苷二氢查耳酮、三叶苷、新橙皮苷二氢查耳酮、根皮素质量浓度均为250.0 mg·L－1,爱德万甜质量浓度为125.0 mg·L－1的混合对照品溶液。

混合对照品溶液系列:移取0.02,0.04,0.10,0.20,0.40,1.00,2.00 mL 混合对 照品溶 液置于50 mL容量瓶中,加50%(体积分数)甲醇溶液稀释至刻度,配制成根皮苷、柚皮苷二氢查耳酮、三叶苷、新橙皮苷二氢查耳酮、根皮素质量浓度均为0.100,0.200,0.500,1.000,2.000,5.000,10.00 mg·L－1,爱德万甜质量浓度为0.050,0.100,0.250,0.500,1.000,2.500,5.000 mg·L－1的混合对照品溶液系列。

根皮苷、柚皮苷二氢查耳酮、新橙皮苷二氢查耳酮、根皮素、三叶苷等标准品的纯度均不小于98%;爱德万甜标准品的纯度不小于97.0%;甲醇、乙腈、乙酸铵均为色谱纯;柠檬酸钾水合物、柠檬酸均为分析纯;试验用水为超纯水,由Purelab Chorus型超纯水系统制备;样品为市售饮料。

1.2 仪器工作条件

Waters ACQUITY UPLCⓇBEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱温40 ℃;流动相为体积比22.5∶77.5的乙腈-50 mmol·L－1柠檬酸盐缓冲液(pH 2.75)的混合液,等度洗脱;流量0.4 mL·min－1;进样量2μL;自动进样器温度5 ℃;ECD,检测池电压650 mV。

1.3 试验方法

1.3.1 样品溶液的配制

称取10 g饮料样品,加水稀释并定容至50 mL容量瓶中,混合均匀,取少量混合液以转速10 000 r·min－1离心10 min,上清液经0.22μm 滤膜过滤后进样分析。

1.3.2 混合加标样品溶液的配制

称取10 g空白饮料,加入一定量的混合对照品溶液,加水稀释并定容至50 mL 容量瓶中,混合均匀,配制成低、中、高等3个浓度水平的混合加标样品溶液,其中根皮苷、柚皮苷二氢查耳酮、三叶苷、新橙皮苷二氢查耳酮、根皮素加标浓度水平均为0.200,1.000,8.000 mg·L－1,爱德万甜加标浓度水平为0.100,0.500,4.000 mg·L－1。取少量混合加标样品溶液以转速10 000 r·min－1离心10 min,上清液经0.22μm 滤膜过滤后进样分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

在优化的试验条件下,混合对照品溶液和混合加标样品溶液(根皮苷、柚皮苷二氢查耳酮、三叶苷、新橙皮苷二氢查耳酮、根皮素的质量浓度为1.000 mg· L－1,爱德万甜的质量浓度为0.500 mg·L－1)的色谱图见图1。

图1 混合对照品溶液和混合加标样品溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of the mixed reference solution and the mixed spiked sample solution

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 检测池电压

将检测池电压设为50～700 mV,逐步升高,将同一混合对照品溶液在不同的电压条件下重复进样,记录各目标物在不同检测池电压条件下的峰面积。以各目标物的峰面积随检测池电压的变化做曲线图,见图2。

图2 目标物的峰面积随检测池电压的变化曲线Fig.2 Curves showing changes of peak area of target with detection cell voltage

结果表明:检测池电压不大于250 mV 时,各甜味剂氧化均不明显;检测池电压大于250 mV 时,二氢查耳酮类甜味剂随着检测池电压的升高逐渐氧化,故选择650 mV 为二氢查耳酮类甜味剂的检测池电压;当检测池电压为250～350 mV 时,爱德万甜迅速氧化,继续升高检测池电压,爱德万甜氧化逐渐降低,但降低不明显。为兼顾二氢查耳酮类甜味剂,试验选择650 mV 为检测池电压。

2.2.2 流动相

在使用ECD 时,流动相中离子浓度需要大于20 mmol·L－1,以保护ECD 的电极。因此,试验考察了以乙腈-50 mmol·L－1乙酸盐缓冲液、乙腈-50 mmol·L－1柠檬酸盐缓冲液作为流动相时的分离效果。结果表明:以乙酸盐作为流动相添加剂时,爱德万甜及5种二氢查耳酮类甜味剂峰形较差;改用柠檬酸盐后,爱德万甜及5种二氢查耳酮类甜味剂的拖尾得到改善,分离度也较好;添加冰乙酸调节酸度,当柠檬酸盐缓冲液的pH 为2.75,乙腈-50 mmol·L－1柠檬酸盐缓冲液的体积比为22.5∶77.5时,爱德万甜及5种二氢查耳酮类甜味剂峰形对称、分离度好,根皮苷、柚皮苷二氢查耳酮、三叶苷、新橙皮苷二氢查耳酮、爱德万甜和根皮素的出峰时间分别为2.2,2.7,3.1,3.9,6.8,8.0 min。因此,试验选择体积比22.5∶77.5的乙腈-50 mmol·L－1柠檬酸盐缓冲液(pH 2.75)的混合液为流动相。

2.3 标准曲线、检出限和测定下限

按照仪器工作条件测定混合对照品溶液系列,记录各目标物的峰面积。以目标物的质量浓度为横坐标,对应的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。所得各目标物的线性参数见表1。

以3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比计算方法的检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),结果见表1。

表1 线性参数、检出限和测定下限Tab.1 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.4 精密度和回收试验

按照1.3.2节试验方法制备低、中、高等3个浓度水平的混合加标样品溶液,分别制备6 份,按照1.2节仪器工作条件进样分析,计算6 种化合物的回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表2。

由表2可知,6种化合物的回收率为97.1%～105%,RSD 为1.4%～5.1%,表明所建立的分析方法的精密度和准确度均满足检测要求。

表2 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.5 稳定性试验

按照1.3.2 节试验方法制备混合加标样品溶液,分别在自动进样器(自动进样器温度5 ℃)中放置0,4,8,12,16,20,24 h后按照1.2节仪器工作条件进样分析。结果表明,测得24 h内混合加标样品溶液中根皮苷、柚皮苷二氢查耳酮、三叶苷、新橙皮苷二氢查耳酮、爱德万甜、根皮素峰面积的RSD(n＝7)分别为1.4%,1.8%,1.6%,1.9%,1.4%,1.6%,说明混合加标样品溶液在24 h 内稳定性较好。

2.6 重复性试验

按照1.3.2节试验方法制备混合加标样品溶液6份,并按照1.2节仪器工作条件进样分析,记录色谱峰峰面积并计算其RSD。结果表明,测得根皮苷、柚皮苷二氢查耳酮、三叶苷、新橙皮苷二氢查耳酮、爱德万甜、根皮素峰面积的RSD(n＝6)分别为1.1%,1.2%,1.4%,1.0%,1.1%,1.7%,说明方法的重复性良好。

2.7 方法比对

2.7.1 ECD 与DAD 的比较

采用DAD 全波长扫描模式,在波长190～400 nm 内对6种化合物进行紫外扫描,根皮苷、柚皮苷二氢查耳酮、三叶苷、新橙皮苷二氢查耳酮、根皮素在280 nm 附近有特异性紫外吸收峰,故选择280 nm 为5种二氢查耳酮类甜味剂的检测波长;爱德万甜最大吸收波长为230,280 nm,考虑到低波长下较多物质均有吸收,可能干扰目标物的测定,故选择280 nm 作为爱德万甜的检测波长。

因此,当色谱柱、流动相、进样体积、柱温等色谱条件一致时,设置DAD 的检测波长为280 nm,ECD的检测池电压为650 mV,对同一低浓度水平的混合加标样品溶液进行检测。采用ECD 进行检测时,6种化合物均可检出,如图3(a)所示;采用DAD 进行检测时,根皮苷、柚皮苷二氢查耳酮、三叶苷、新橙皮苷二氢查耳酮可检出,但信噪比较低,爱德万甜、根皮素的信号响应值均低于仪器检出限,无法检出,如图3(b)所示。上述结果表明,采用ECD 检测饮料中的根皮苷、柚皮苷二氢查耳酮、三叶苷、新橙皮苷二氢查耳酮、爱德万甜、根皮素,灵敏度高,具有明显的优势。

图3 ECD与DAD检测同一混合加标样品中6种化合物的色谱比较Fig.3 Comparison of chromatograms of the 6 compounds in the same mixed spiked sample detected with ECD and DAD

按照1.3.2 节试验方法制备混合加标样品溶液,共制备4个浓度水平,每个浓度水平平行制备3份。当色谱柱、流动相、进样体积、柱温等色谱条件一致时,分别采用ECD(检测池电压650 mV)和DAD(检测波长280 nm)对上述混合加标样品溶液进行测定,采用软件Origin 8对所得的各目标物的测定值进行独立样本t检验,结果如表3所示。

由表3可知:使用DAD检测时,当各目标物质量浓度为0.050 mg·L－1时,无法准确定量,均低于检出限,当各目标物质量浓度为0.100 mg·L－1时,DAD可对根皮苷、柚皮苷二氢查耳酮、三叶苷、新橙皮苷二氢查耳酮进行准确定量,而对根皮素依然不能准确定量;使用ECD 检测时,4 个浓度水平下,6种目标物均可准确定量。说明使用ECD 检测时,灵敏度高、检出限低,优势明显。独立样本t检验显示,在0.100,0.500,1.000,4.000,8.000 mg·L－1浓度水平下P值均大于0.05,表明使用ECD 和DAD检测饮料中根皮苷、柚皮苷二氢查耳酮、三叶苷、新橙皮苷二氢查耳酮、爱德万甜、根皮素时,方法均无显著性差异。

表3 ECD和DAD测定结果比较Tab.3 Comparison of determined results with ECD and DAD

2.7.2 同文献方法的比较

由于试验所测甜味剂中爱德万甜的甜度最高,对检测方法的灵敏度要求最高,因此将本方法(UHPLC-ECD)同文献中爱德万甜的检测方法进行了比较。目前已公开的检测方法中,超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)的检出限为2.0～6μg·kg－1,HPLC-DAD 的检出限为100,600μg·kg－1,本方法的检出限为19μg·kg－1,具体见表4。

表4 数据表明,本方法的灵敏度略低于UHPLC-MS/MS,但高于HPLC-DAD;本方法检测成本远低于UHPLC-MS/MS,分析时间相较于HPLC-DAD 大大缩短。

表4 本方法同其他方法的比较Tab.4 Comparison of this method with other methods

2.8 样品分析

采用试验方法对市售的10个饮料样品进行前处理,并按仪器工作条件对爱德万甜及5种二氢查耳酮类甜味剂的含量进行测定,结果表明,10个饮料样品均未检出上述化合物。

本工作采用UHPLC-ECD 同时测定饮料中爱德万甜和5种二氢查耳酮类甜味剂的含量,在提高灵敏度、降低成本的同时,大大缩短了分析时间。该方法操作简单,色谱分离效果和稳定性好,并可获得较高的精密度和准确度,适合大批量样品的快速测定,同时可为其他食品的快速测定提供参考。