慢病毒介导的短发夹RNA敲低PIWIL2基因对肝母细胞瘤细胞生物学行为的影响

李桐 杨霞 陈胜男 何静 刘瑶 郝希伟 夏楠 董蒨，

(青岛大学附属医院，山东 青岛 266003 1 小儿外科； 2 数字医学与计算机辅助手术实验室)

肝母细胞瘤(hepatoblastoma，HB)是儿童最常见的肝脏恶性肿瘤，约占儿童肝脏原发性恶性肿瘤的80%[1]，且近年来全球HB的年发病率呈上升趋势。手术切除联合化疗提高了HB患儿的长期生存率(5年生存率已达80%以上)[2]，但仍有部分患儿化疗效果不佳，出现复发，致预后较差[3]。关于HB发生的启动基因以及靶向药物治疗一直是目前的研究热点[4-6]。本研究团队前期根据16例HB患儿的肿瘤组织及瘤旁正常组织全外显子测序的结果，进行生物信息学分析，筛选出一个新的候选基因——PIWL样蛋白2(PIWIL2)基因，目前研究结果显示PIWIL2在食管鳞状细胞癌、肝癌等多种人类肿瘤组织中的表达均上调，提示该基因可能参与了这些肿瘤的发生发展[7]。但PIWIL2基因在HB中的功能尚未见报道。基于此，本研究应用免疫组织化学(IHC)方法对HB肿瘤组织及其瘤旁正常组织中PIWIL2蛋白的表达进行检测，并通过构建慢病毒介导的短发夹RNA(shRNA)载体敲低HB细胞HUH6中PIWIL2，进一步探讨PIWIL2对于HB细胞增殖和迁移的影响，探讨HB的发病机制和潜在的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料来源

收集2015年7月—2020年12月青岛大学附属医院小儿外科收治的经病理组织学检查确诊的33例HB患儿的肿瘤组织及瘤旁正常组织标本。HB细胞HUH6、正常肝细胞LO2购自中国科学院细胞库(上海)，逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒(南京诺唯赞生物技术有限公司)，CCK-8试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司)，慢病毒载体及转染试剂(上海吉凯基因医学科技股份有限公司)，PIWIL2多克隆抗体、GAPDH单克隆抗体(英国Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1IHC方法检测患儿HB组织中PIWIL2蛋白的表达 将33例患儿的HB组织及瘤旁正常组织标本经过40 g/L甲醛溶液固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，3 μm厚切片。按照试剂盒说明书进行IHC，封片，于倒置光学显微镜下观察染色结果并对病理切片进行全景扫描。IHC结果判读标准：①染色强度：不着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分。②阳性细胞百分比：无阳性细胞为0分，阳性细胞比例<30%为1分，阳性细胞比例30%～60%为2分，阳性细胞比例>60%为3分。染色强度和阳性细胞百分比的乘积为最终IHC评分结果。

1.2.2HUH6细胞及LO2细胞培养和HUH6细胞的感染 HUH6细胞及LO2细胞在含体积分数0.05青链霉素溶液以及体积分数0.10胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养液中于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的饱和湿度培养箱中培养，培养至对数生长期后用于后续实验。首先根据慢病毒感染手册进行HUH6细胞慢病毒感染的预实验，结果显示慢病毒感染HUH6细胞的最佳感染复数(MOI)为10，最佳作用时间为12 h，作为后续HUH6细胞的感染条件。分别以shRNA-PIWIL2慢病毒和阴性对照慢病毒感染HUH6细胞，分为实验组和对照组，感染12 h以后更换完全培养液继续培养，感染72 h后，荧光显微镜下观察被感染细胞的荧光强度，计算荧光细胞的比例，采用含2 mg/L嘌呤霉素的完全培养基对两组细胞进行筛选，获得稳定感染的细胞，培养至对数生长期后用于后续实验。

1.2.3RT-qPCR检测HUH6细胞、LO2细胞及实验组、对照组细胞PIWIL2 mRNA的表达 取处于对数生长期的HUH6细胞、LO2细胞及实验组、对照组细胞，使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，并使用逆转录试剂盒合成cDNA，根据RT-qPCR试剂盒使用说明书配置反应体系并进行RT-qPCR，以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为对照，采用2-△△CT法计算目的基因的相对表达量。引物名称及其序列见表1。每个样品均设置3个复孔，实验重复3次，结果取均值。

表1 引物名称及其序列 Tab.1 Primer names and sequences

1.2.4克隆形成实验、CCK-8实验检测细胞的增殖能力 克隆形成试验：取处于对数生长期的两组细胞，以每孔约1 000个细胞接种于6孔板中，每组设3个复孔。培养至第14天，PBS洗涤3次，甲醛固定后以2.50 g/L结晶紫染液进行染色，蒸馏水冲洗，室温晾干后显微镜下观察并拍照。以Image J软件计算细胞克隆形成数目，实验重复3次，结果取均值。CCK-8实验：取处于对数生长期的两组细胞，以每孔约3 000个细胞接种于96孔板中，每组6个复孔，严格按照CCK-8试剂盒说明书操作，分别于第1～4天同一时间点使用酶标仪检测波长450 nm处各孔的吸光度值，实验重复3次，结果取均值。

1.2.5Transwell迁移实验检测细胞迁移能力 将包含处于对数生长期两组细胞的培养液更换为无FBS培养液，培养12 h后，以每孔约2×105个细胞接种于上层小室中，下室加入600 μL含体积分数0.20的FBS培养液，培养48 h后，拭去上层小室细胞，PBS洗涤3次，甲醛固定后以2.50 g/L结晶紫染液进行染色，再蒸馏水冲洗，室温晾干后显微镜下观察并拍照。以Image J软件计算迁移细胞数。实验重复3次，结果取均值。

2 结 果

2.1 HB肿瘤组织及瘤旁正常组织中PIWIL2蛋白的表达

IHC染色和全景扫描结果显示，HB患儿肿瘤组织中PIWIL2蛋白表达为强阳性，肿瘤细胞胞质呈棕褐色，癌旁组织中PIWIL2蛋白表达为弱阳性或阴性，细胞质呈淡黄色或不着色(图1)。PIWIL2蛋白定位于细胞质，黑色箭头示肿瘤组织，细胞质呈棕褐色；白色箭头示瘤旁正常组织，细胞质呈淡黄色。肿瘤组织和瘤旁正常组织中PIWIL2蛋白的IHC评分分别为(7.24±2.19)、(3.42±2.14)分，两者比较差异有显著性(t=7.16，P<0.05)。

图1 HB患儿肿瘤组织及瘤旁正常组织中PIWIL2蛋白表达(IHC染色，100倍)Fig.1 The protein expression of PIWIL2 in tumor tissue and adjacent tissue in children with HB (IHC staining, ×100)

2.2 两种或两组细胞中PIWIL2 mRNA的表达水平比较

HUH6细胞与LO2细胞PIWIL2 mRNA相对表达量分别为184.50±15.30、1.00±0.35，两者比较差异具有显著性(t=20.77，P<0.05)。对照组和实验组HUH6细胞PIWIL2 mRNA的相对表达量分别为1.00±0.11、0.22±0.06，两者比较差异具有统计学意义(t=11.74，P<0.05)

2.3 两组细胞增殖能力、迁移能力比较

克隆形成实验结果显示，对照组和实验组细胞克隆形成数目分别为220.30±17.03、74.67±8.67，两者比较差异具有显著的意义(t=7.62，P<0.05)。CCK-8实验结果显示，时间、组别及时间与组别交互作用均对细胞的增殖有明显影响(F组别=86.48，F时间=138.95，F时间*组别=33.08，P<0.05)；单独效应分析结果显示，与第1天相比，两组第2～4天细胞的增殖水平明显提高(F=22.35～149.68，P<0.05)，与对照组第3、4天相比，实验组第3、4天细胞增殖水平明显降低(F=17.68、165.40，P<0.05)。见表2。Transwell迁移实验结果显示，对照组与实验组迁移至下室的细胞数分别为266.70±9.21、56.33±5.55，两者比较差异具有显著性(t=20.05，P<0.05)。

表2 两组细胞增殖能力比较Tab.2 Comparison of cell proliferation ability between the two groups

3 讨 论

近年来针对肿瘤治疗的靶向药物取得显著进展，通过靶向药物特异性地作用和调控肿瘤发生过程中的靶分子及信号通路，从而达到治疗肿瘤的目的[8]。HB作为儿童肝脏恶性肿瘤，长期以来威胁儿童的生命健康，HB发病机制并不明确，因此进一步探寻HB发生机制及治疗的新靶点尤为重要。

PIWIL2属于Argonaute蛋白家族的Piwi亚族，Piwi亚族在胚胎形成发育以及干细胞的自我更新中发挥着重要的作用[9]。目前对其家族中PIWIL2基因研究最多。正常情况下，PIWIL2仅表达于生殖细胞和胚胎干细胞中，在生殖细胞发育和维持胚胎干细胞的多能性方面起核心作用[10-11]，同时PIWIL2在多种恶性肿瘤中也作为促癌基因发挥显著作用[12-15]。LI等[16]研究发现，PIWIL2蛋白在结肠癌组织中的阳性表达率明显高于邻近的非结肠癌组织；WANG等[17]进一步发现，PIWIL2广泛表达于结肠癌及其癌前病变腺瘤组织中，且从癌旁正常组织、腺瘤组织到结肠癌PIWIL2蛋白阳性表达率呈递增趋势，提示PIWIL2可能对结肠癌具有早期诊断意义。ZHAO等[18]的研究显示，PIWIL2在食管鳞状细胞癌中高表达，且与疾病发生发展及预后关系密切，也表明PIWIL2表达可能与肿瘤的预后有关。本研究应用IHC方法法检测HB患儿肿瘤组织及瘤旁正常组织中PIWIL2蛋白的表达情况，结果显示，肿瘤组织中PIWIL2蛋白表达水平显著高于瘤旁正常组织，另外RT-qPCR检测结果也显示PIWIL2在HUH6细胞中高表达，在LO2细胞中低表达，提示PIWIL2可能在HB发病中发挥着重要作用。

肿瘤的生物学行为包括异型性、转移和扩散，恶性肿瘤的特征表现为短时间内的过度增殖和失控性生长，这是由于肿瘤细胞恶性增殖的发生及抗凋亡机制的激活导致的[19-20]。肿瘤细胞通过多种途径诱导部分或全部的凋亡途径失活，以维持细胞持续增殖[21]。有研究发现PIWIL2的高表达与肿瘤细胞及肿瘤干细胞的增殖、凋亡以及细胞的转移、侵袭等均显著相关，PIWIL2敲低可诱导肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞生长[22-25]。本研究为进一步揭示PIWIL2在HB细胞生物学行为中的作用，采用慢病毒介导shRNA敲低HUH6细胞中PIWIL2的表达，CCK-8实验、克隆形成实验及Transwell迁移实验结果均显示，敲低PIWIL2会抑制HUH6细胞的增殖和迁移，提示PIWIL2在HB的发生发展中具有重要作用。

近年来的研究证实PIWIL2可通过不同途径调控肿瘤的发生发展，沉默PIWIL2可下调前列腺癌上皮细胞-间质转化相关调控因子Snail、Slug和Twist的表达，还可以降低基质金属蛋白酶9的表达[26]。PIWIL2可通过P38途径磷酸化角蛋白8来抑制其降解，从而抑制Fas介导的细胞凋亡[27]。ZHANG等[28]通过用PIWIL2基因对人包皮成纤维细胞进行重编程，将稳定过表达PIWIL2细胞接种到裸鼠体内，成瘤率100%，肿瘤组织中干细胞相关转录因子Oct-4、Nanog以及Sox2表达上调，提示PIWIL2可以促进成纤维细胞向肿瘤干细胞恶性转化，并进一步对获得的肿瘤干细胞样细胞转录组测序发现，PIWIL2可能参与了DNA损伤修复以及碱基错配修复、碱基切除修复等途径[29]。此外，PIWIL2抑制GSK3β诱导的β-catenin磷酸化和泛素化，从而增加β-catenin在细胞核中的积累，上调β-catenin和细胞周期蛋白D1表达，可促进肿瘤细胞的增殖[14]。Wnt/β-catenin通路是诱导HB发生最主要的一条通路，多达80%的HB患者中可检测到CTNNB1(编码β-catenin)基因的突变[5]，提示PIWIL2在HB发生中起着至关重要的作用。

综上所述，PIWIL2在HB肿瘤组织及HUH6细胞中高表达，敲低PIWIL2能明显抑制HUH6细胞增殖，降低细胞迁移能力，提示PIWIL2可能具有调节HB细胞增殖与迁移能力。后续本课题组会进一步探讨PIWIL2调控HB细胞增殖和迁移的关键通路，以进一步阐述HB发生发展的机制。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

伦理批准和知情同意：本研究涉及的所有试验均已通过青岛大学附属医院医学伦理委员会的审核批准(文件号QYFYWZLL27051)。所有试验过程均符合《赫尔辛基宜言》。受试对象亲属已经签署知情同意书。

EthicsApprovalandPatientConsent： All experimental protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University (Approval Letter No. QYFYWZLL27051), and all experimental protocols were carried out by following the Declaration of Helsinki. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者贡献：李桐、杨霞、陈胜男、何静、刘瑶、董蒨参与了研究设计；李桐、郝希伟、夏楠、董蒨参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。

Contributions： The study was designed byLITong,YANGXia,CHENShengnan,HEJing,LIUYao, andDONGQian. The manuscript was drafted and revised byLITong,HAOXiwei,XIANan, andDONGQian. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.