重组人Dickkopf相关蛋白3在弥漫性大B细胞淋巴瘤患者中的表达及其临床意义

许京淑，徐奔，向国强，向航

(恩施土家族苗族自治州中心医院血液病科，湖北 恩施 445000)

临床上约30%的霍奇金淋巴瘤淋巴瘤为弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)[1]。DLBCL患者临床表现特异性小，确诊时多为中晚期，严重影响治疗效果[2]。目前DLBCL主要通过影像学检查与病理学联合诊断，但以上技术在判定患者预后方面具有一定局限性。DLBCL患者免疫表型、病理学等特征差异较大，表现为高度异质性，进一步增加了治疗的难度[3]。有学者认为DLBCL临床治愈率较低、预后差，与其缺乏特异性的标志物密切相关[4]。近年来癌症筛查技术取得了长足发展，其中在乳腺癌、胃癌及结肠癌等肿瘤中发挥重要作用的Wnt信号通路的抑癌因子分泌型蛋白Dickkopf相关蛋白3(Dickkopf-associated protein 3，DKK3)引人关注[5]。在癌细胞中，DKK3基因可调控c-myc以及细胞周期蛋白D1等靶基因，进一步阻滞下游信号通路Wnt而抑制肿瘤侵袭、转移[6]。研究发现，DKK3低表达是胃癌、乳腺癌等不利的预后因素，因此，鉴定肿瘤组织的DKK3表达水平对判定肿瘤预后可能有一定帮助，而DKK3对DLBCL预后的影响尚缺乏研究依据[7]。本研究主要探讨DKK3蛋白水平在DLBCL患者中的变化及其与预后的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 纳入2017年12月至2019年12月恩施土家族苗族自治州中心医院收治的56例DLBCL患者，将术中切除的DLBCL组织与癌旁组织作为检测标本。纳入标准：①经病理确诊为DLBCL且符合《恶性淋巴瘤诊断治疗学》[8]分类标准；②年龄≥18岁；③临床资料完整；④进行R-CHOP(利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松)方案或R-CHOEP(依托泊苷联合R-CHOP)方案或多柔比星、长春新碱等化疗；⑤生存期预计≥3个月。排除标准：①合并免疫系统疾病、肝肾功能重度异常者；②继发其他肿瘤；③DLBCL复发者；④失访者；⑤原发中枢神经系统的DLBCL；⑥精神疾病史及认知障碍者。其中男30例、女26例，年龄29～72岁，平均(53±7)岁；Ann Arbor分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期19例，Ⅲ期17例，Ⅳ期11例；疾病类型：生发中心型42例，非生发中心型14例。本研究获得恩施土家族苗族自治州中心医院医学伦理委员会批准，患者或家属均签署了知情同意书。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学法检测DKK3蛋白表达 制作组织微阵列蜡块后切成厚度约4 μm的组织切片，常规脱蜡水化后，用磷酸盐缓冲液冲洗3次，浸入0.01 mol/L的枸橼酸盐缓冲液，抗原修复后加入3% H2O2室温孵育10 min，室温下羊血清孵育1 h，加浓度为1∶80的一抗DKK3(北京新力生物科技公司生产，批号：ab35847)抗体于4 ℃过夜；次日取出用磷酸盐缓冲液冲洗，加入二抗工作液，37 ℃孵育15 min，磷酸盐缓冲液冲洗3次，滴加以辣根过氧化物酶标记的工作液，37 ℃孵育15 min，磷酸盐缓冲液冲洗3次，采用二氨基联苯氨显色，纯水终止反应，苏木精复染，返蓝、中性树胶封片[9]。

1.2.2染色结果判定标准 随机挑选并观察光学显微镜下每张切片的3个高倍视野，采用半定量的方法进行结果判定。着色细胞比例评分：0%为0分，1%～10%为1分，11%～50%为2分，>50%为3分；染色强度评分：阴性为0分，淡黄色为1分，棕黄褐色为2分[10]。总评分=着色细胞比例评分×染色强度评分，总评分≥4分判定为阳性，<4分判定为阴性。

1.3随访及预后评价标准 行门诊或电话随访，随访截至2020年12月31日。根据世界卫生组织制订的疗效标准[11]评价术后1年患者的临床疗效。完全缓解：病灶彻底消失；部分缓解：病灶最大直径减少≥50%，稳定≥1个月；无缓解：病灶未变化或缓解不明显。总有效率=(完全缓解例数+部分缓解例数)/总例数×100%。在随访结束时统计分析中位无进展生存期。

2 结 果

2.1DKK3在DLBCL组织和癌旁组织中的表达 免疫组织化学检测结果显示，DLBCL组织中DKK3蛋白阳性表达率明显低于癌旁组织[42.86%(24/56)比83.93%(47/56)](χ2=7.782，P<0.001)，见图1。

注：DLBCL为弥漫性大B细胞淋巴瘤，DKK3为Dickkopf相关蛋白3

2.2DLBCL患者DKK3蛋白表达与临床特征的关系 不同性别、年龄、累及部位、乳酸脱氢酶水平、疾病类型以及有无B症状的DKK3阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)，但临床分期Ⅰ～Ⅱ期的DKK3阳性表达率高于Ⅲ～Ⅳ期，国际预后指数评分0～2分的DKK3阳性表达率高于3～4分(P<0.05)。见表1。

表1 DLBCL患者DKK3蛋白表达与临床特征的关系

2.3DKK3蛋白表达与DLBCL患者预后的关系 术后1年DKK3阳性表达的DLBCL患者的总有效率明显高于DKK3阴性表达患者[79.17%(19/24)比53.13%(17/32)](χ2=4.051，P=0.044)，DKK3阳性表达的临床疗效优于DKK3阴性表达患者(Z=2.127，P=0.014)，见表2。至随访结束，DKK3阳性表达的DLBCL患者中位无进展生存期长于DKK3阴性表达患者[(36±6)个月比(22±4)个月](t=9.775，P<0.001)。

表2 DKK3蛋白表达与DLBCL患者预后的关系 (例)

3 讨 论

DLBCL是临床常见的淋巴瘤类型之一，目前治疗主要以化疗为主[12]。60%～70%的DLBCL患者使用利妥昔单抗、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松等方案可达到较好的治疗效果[13]。而部分患者在发病早期即出现远处转移，近50%的患者治疗后期出现复发，但具体发病机制目前尚不清楚，可能原发于小淋巴细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤等，也可从淋巴结外组织等发展而来[14-15]。研究发现，DLBCL患者化疗敏感性、预后与免疫组织分型、细胞学及病理学等密切相关[16]。因此，探讨DLBCL发生发展的分子机制及相关蛋白、基因等生物学特征，对进一步提高DLBCL的早期诊断率和改善患者预后尤为必要[17]。

目前，临床主要通过B超、磁共振成像及CT等影像学技术对DLBCL进行早期诊断，该类技术虽然定位准确但定性难度大。基因标志物被认为是一种无创性辅助诊断方法，目前DLBCL仍缺乏特异性检测指标。此外，影响DLBCL预后的因素较多，同时DLBCL在临床上有多种分子分型，考虑患者的分子分型与基因异常存在部分重合，任意单一因素变化均可能造成较大影响，提示DLBCL的调控基因复杂且具有显著异质性[18]。因此，在庞杂的调控基因中准确找到对DLBCL患者诊断与预后有临床意义的标志物是当前急需解决的问题。

Wnt信号转导通路可介导调控多种恶性肿瘤的增殖分化过程，其高度活化时可积聚胞质内下游蛋白(β联蛋白)，使下游蛋白进入细胞核触发原癌基因转录翻译机制，导致肿瘤细胞异常增殖分化[19]。随着近年来临床筛查肿瘤标志物工作的陆续开展，发现潜在肿瘤标志物DKK3具有较好的应用前景，现研究证明其在胃癌、肠癌及输卵管癌中可作为潜在治疗新靶点[20-21]。DKK3基因是经典Wnt信号转导通路的重要负性调控因子，是一种肿瘤抑制因子，在多种癌症中低表达，在肿瘤增殖分化中起关键作用[22]。DKK3基因高表达可调控c-myc以及细胞周期蛋白D1等靶基因，从而下调下游信号通路Wnt发挥抑制肿瘤侵袭转移的作用[23]。此外，有研究发现过表达DKK3可通过介导血管内皮生长因子受体2抑制肿瘤血管生成[24]。目前研究发现在多种肿瘤细胞中DKK3基因处于低表达状态，值得注意的是DKK3基因表达缺失的直接原因为该基因启动子区的高甲基化，在胃癌组织中肿瘤细胞主要通过高甲基化或启动子甲基化沉默DKK3基因[25]。当前异常的启动子甲基化已在生殖系统及消化系统肿瘤DKK3基因中发现，其直接影响患者肿瘤恶性程度及预后，提示DKK3基因可作为肿瘤患者病情判定及评估预后的潜在标志物[26]。目前，有关DKK3基因与DLBCL的相关性研究较少。有研究报道，DKK3蛋白表达水平与卵巢癌患者总生存率呈正相关，且DKK3蛋白表达水平与患者的分期、淋巴转移、浸润程度密切相关[27]。

本研究结果显示，DLBCL组织DKK3阳性率低于癌旁组织(P<0.01)，DLBCL患者DKK3蛋白表达与临床分期和国际预后指数评分之间存在关联(P<0.05)，但与性别、年龄、累及部位及乳酸脱氢酶水平不存在显著性关联(P>0.05)。Dellinger等[28]研究认为，DKK3启动子中的甲基化标志着子宫内膜癌预后不良，提示DKK3高表达可能抑制肿瘤组织细胞的分化、增殖及浸润过程。本研究结果为DKK3蛋白表达水平与其他肿瘤发生发展存在相关性提供了支持。本研究结果同时提示DKK3蛋白阳性表达患者的总有效率高于DKK3蛋白阴性表达(P<0.05)，无进展生存期明显长于DKK3蛋白阴性表达者(P<0.01)，提示DLBCL患者预后与DKK3表达情况存在关联，表明DKK3阳性患者术后生存期更长，提示其作为抑癌基因对DLBCL患者预后产生积极影响。以上证据表明，DKK3基因过表达在诊断DLBCL中的潜在价值，DKK3表达增强可能是DLBCL发生发展的重要因素之一。未来对DKK3蛋白不同活化程度的DLBCL患者可采取不同的治疗方式，同时做到积极随访及密切监测以改善患者预后。

综上所述，在部分DLBCL患者组织中DKK3阳性表达，且其阳性表达率与患者临床分期及国际预后指数评分相关，DKK3蛋白阴性表达预示着预后较差，其有望成为DLBCL临床诊断、治疗及判断预后的新指标。