高效液相色谱法测定畜禽肉中8种生物胺含量国家标准方法的改进

闵 盛，孙 群，汪 洋，戴 琴，王德玉，王 硕

(成都市药品检验研究院,成都 610045)

生物胺是一类具有生物活性的低相对分子质量的含氮有机化合物的总称,结构上可看作是氨中的氢原子被烷基、芳基或杂环基取代后生成的化合物。按结构可将其分为脂肪族胺、芳香族胺和杂环族胺;按组成成分可分为单胺、二胺和多胺;按挥发难易程度可分为挥发性胺、非挥发性胺[1-2]。常见生物胺包括组胺、酪胺、色胺、尸胺、苯乙胺、腐胺、精胺和亚精胺等[3-4]。低含量的生物胺对人体细胞增殖分化、核酸功能调节等代谢活动有重要作用,但当积累过多生物胺或由遗传、胃肠道疾病及酒精摄入导致体内胃肠道上胺氧化酶活性不足时,便会引起一系列疾病,如头痛、腹泻、高血压及心悸等[5-6]。其中,组胺的毒性最强,酪胺次之;腐胺和尸胺会抑制组胺、酪胺代谢酶的活性,增强组胺、酪胺的毒性,其还会与食品中的亚硝酸盐反应生成N-亚硝胺致癌物[7]。畜禽肉含有丰富的蛋白质,而蛋白质分解为其腐败变质的特征,生物胺是蛋白质受到组织酶或微生物蛋白酶的作用分解得到的产物,鉴于生物胺的毒性,加强对畜禽肉中生物胺的检测具有非常重要的作用。

目前文献报道的生物胺的检测方法主要有气相色谱法[8]、离子色谱法[9]、高效液相色谱法[10-13]、高效液相色谱-质谱法[14-16]、电化学生物传感器法[17]、薄层色谱法[18]、毛细管电泳法[19]、酶联免疫法[20]、胶束液相色谱法[21]等。其中,高效液相色谱法使用较普遍,也被国家标准GB 5009.208－2016《食品安全国家标准 食品中生物胺的测定》[22]采用。国家标准方法需要进行多次提取、多次净化、丹磺酰氯柱前衍生等步骤,操作较为繁琐、耗时较长(约6 h),且对衍生条件要求比较苛刻,不适用大批量样品分析。在此基础上,本工作简化了前处理条件,在保证结果准确的前提下大大提高了检测效率,能较好地满足实际检测需要。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Ultimate 3000型高效液相色谱仪,配二极管阵列检测器;BP211D 型电子天平(感量0.01 mg);HZS-H 型水浴振荡器;Milli-Q 型纯水仪;e 5810 R型高速冷冻离心机;H H·S 1-Ni型电热恒温水浴锅。

单标准储备溶液:1 000 mg·L－1,取各生物胺标准品约10 mg,用0.1 mol·L－1盐酸溶液溶解并稀释至10.0 mL,摇匀备用。

混合标准溶液系列:取适量各生物胺标准储备溶液,用0.1 mol·L－1盐酸溶液逐级稀释至质量浓度分别为5.00,12.5,25.0,50.0,75.0,125,250 mg·L－1的混合标准溶液系列,摇匀备用。

内标溶液:1 000 mg·L－1,取1,7-二氨基庚烷标准品约10 mg,用0.1 mol·L－1盐酸溶液溶解并稀释至10.0 mL,摇匀备用。

丹磺酰氯衍生溶液:10 g·L－1,取适量丹磺酰氯,以丙酮溶解并定容,置于4 ℃冰箱避光储存。

色胺、尸胺标准品的纯度为99.3%;β-苯乙胺、酪胺、亚精胺标准品的纯度为99.9%;腐胺标准品的纯度为99.8%;组胺标准品的纯度为100.0%;精胺标准品的纯度为99.6%;1,7-二氨基庚烷标准品的纯度为98.7%。

甲醇、丙酮、正己烷均为色谱纯;其他试剂为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

Phenomenex Kinetex 色谱柱(100 mm ×4.6 mm,2.6μm);柱温30 ℃;检测波长254 nm;进样体积10μL;流量1.5 mL·min－1;流动相A 为甲醇,B为水,梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution procedure

1.3 试验方法

取绞碎样品10 g,置于50 mL 具塞锥形瓶中,加入50 g·L－1三氯乙酸溶液20 mL、正己烷10 mL及内标溶液1.0 mL,混匀,涡旋提取15 min,超声提取15 min,以8 000 r·min－1转速离心5 min。取0.5 mL 上清液置于10 mL 比色管中,依次加入2 mol·L－1氢氧化钠溶液100μL、饱和碳酸氢钠溶液300μL、丹磺酰氯衍生溶液2.0 mL,振荡混匀,于60 ℃反应15 min。取出比色管,加入100μL氨水,振荡混匀,于60 ℃保温15 min,以终止衍生反应。加入乙腈稀释至5 mL,振荡混匀,用0.22μm 滤膜过滤,滤液按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 提取方法的选择

和国家标准GB 5009.208－2016相比:①本方法以一次性加入三氯乙酸溶液并用涡旋和超声相结合方法提取样品,避免了分次提取涡旋时间长、上清液浑浊导致过滤时间长等问题;②同时加入三氯乙酸溶液和正己烷即可得到澄清上清液,省去了单独除脂步骤;③净化操作对测定影响不大,省去了用体积比1∶1的正丁醇-三氯甲烷混合溶液萃取净化的步骤。

2.2 衍生方法的选择

和国家标准GB 5009.208－2016相比,本方法直接以氢氧化钠溶液和碳酸氢钠溶液调节溶液酸度,然后加入丹磺酰氯衍生溶液衍生,以氨水终止反应,所得色谱图中,杂质色谱峰对生物胺基本无干扰,且各生物胺的回收率均在80.0%以上,省去了吹氮除丙酮、乙醚萃取并氮吹至干等步骤。

2.3 色谱条件的优化

与传统C18色谱柱相比,Phenomenex Kinetex色谱柱(100 mm×4.6 mm,2.6μm)采用了新型核-壳技术,极大缩短了溶质传质过程和运行时间,提高了分离度,8种生物胺可在20 min内完成分离,比常规检测(约40 min)节约了近一半时间。

在最优试验条件下,可在约1.5 h内完成样品分析,所得50.0 mg·L－1混合标准溶液和加标样品溶液(加标量50.0 mg·L－1)的色谱图见图1。

图1 混合标准溶液和加标样品溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of the mixed standard solution and the spiked sample solution

2.4 标准曲线、检出限和测定下限

取0.5 mL混合标准溶液系列,置于10 mL 比色管中,加入内标溶液25μL,按照试验方法衍生并测定,以各生物胺的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标进行线性回归,所得标准曲线的线性范围为5.00～250 mg·L－1,其他线性参数见表2。

分别以3倍、10倍信噪 比(S/N)计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),所得结果见表2。

表2 线性参数、检出限和测定下限Tab.2 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

由表2 可知,8 种生物胺的检出限为4～21μg·kg－1,满足GB/T 5009.208－2016 对检出限的要求。

2.5 精密度和回收试验

按照试验方法分析6 份加标样品(加标量为1 mg),1 d之内完成测定,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),所得结果见表3。再连续测定4 d,所得测定值的RSD 见表3。

表3 精密度和回收试验结果Tab.3 Results of tests for precision and recovery

由表3可知,8种生物胺的回收率为80.4%～95.6%,日 内RSD 为1.9%～5.1%,日 间RSD 为2.3%～6.2%,满足日常检测要求。

2.6 样品分析

按照试验方法分析20 批畜禽肉样品,结果见表4。

由表4可知,在20批样品中,组胺均未检出,精胺均有不同程度检出,生物胺总量大于100 mg·kg－1的样品有6批,说明该方法能用于检测畜禽肉中8种生物胺。

表4 样品分析结果Tab.4 Analytical results of the samples mg·kg-1

本工作在国家标准GB 5009.208－2016提供的高效液相色谱法基础上,简化了样品提取、衍生化过程,省去了净化操作,不仅使样品分析时间从6 h缩短至1.5 h,而且还降低了样品损失和试剂耗费成本,方法的检出限、精密度和准确度均符合要求,可用于畜禽肉样品的批量分析。