两种方法测定不同养殖模式下中华鳖鳖裙中胶原蛋白的含量

王 芬，陈 祝，宋光同，方国侠，朱成骏，周 翔，蒋业林*

(1.安徽省农业科学院水产研究所,合肥 230031; 2.安徽省鳖类养殖工程技术研究中心,蚌埠 233701;3.水产增养殖安徽省重点实验室,合肥 230031; 4.安徽杰与祥水产养殖有限公司,合肥 231221)

中华鳖,俗称甲鱼、团鱼,自20世纪90年代开始进行人工养殖,除西藏、青海、新疆外,其余各省均有养殖。养殖模式包括温室养殖、池塘养殖、生态养殖(鳖植共作),其中温室-外塘两段式和鳖植共作为常见模式,鳖植共作模式有稻鳖共作、藕鳖共作、茭鳖共作等。人工养殖推动了中华鳖市场的蓬勃发展,其养殖产量逐年上升。2019年的养殖产量约占当年全国淡水水产养殖量的1%[1]。中华鳖是典型的低脂高蛋白食品,鳖裙中的粗蛋白质量分数为20%～24%[2]。胶原蛋白具有抗氧化、提高抵抗力、促进伤口愈合以及美容等功效,已被广泛用于生物材料、食品、化妆品、医药等行业[3-4]。目前已知的胶原蛋白有29 种,其中种类最多的是Ⅰ型胶原蛋白[5]。文献[6]发现,鳖裙中的胶原蛋白为典型的Ⅰ型胶原蛋白。

目前中华鳖的相关文献主要集中在中华鳖营养成分以及风味物质的研究上[7-9],而关于不同养殖模式对鳖裙中胶原蛋白影响的研究较少[10]。为了科学指导中华鳖的养殖及消费,很有必要提供一种准确、快速测定中华鳖鳖裙中胶原蛋白含量的方法。羟脯氨酸是胶原蛋白的特征氨基酸,可用其含量计算胶原蛋白的含量[11]。该物质的测定方法主要有紫外-可见分光光度法(UV-Vis)[3,11]、液相色谱法[12]、液相色谱-质谱联用法[13]、氨基酸分析法[14]等。紫外-可见分光光度法仪器价格较低、操作方便、极易上手,但是分析精度相对较差;液相色谱法仪器较紫外-可见分光光度计价格高,分析精度也较高,但是需要一定的理论知识积累和操作熟练度;液相色谱-质谱联用法仪器价格最为昂贵,分析精度最高,对操作人员的要求也较高;氨基酸分析法是分析氨基酸种类和测定氨基酸含量较为精密的一种方法,对操作人员有一定的技术要求。鉴于此,本工作以温室-外塘两段式和藕鳖共作模式养殖的中华鳖为待测对象,采用操作要求较高,精密度最高的高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)和操作最为简便的UV-Vis测定鳖裙中羟脯氨酸含量,以期为不同养殖模式对鳖裙中胶原蛋白影响的研究提供参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

岛津LC-MS-8050型三重四极杆液质联用仪;岛津UV-2550 型紫外-可见分光光度计;Millipore Milli-Q Integral型纯水系统。

标准储备溶液:500 mg·L－1,取50 mgL-羟脯氨酸标准品,用水溶解并定容至100 mL容量瓶中,摇匀备用。

标准溶液系列1:取适量标准储备溶液,用水逐级稀释,配制成1,2,5,10,20,50,100μg·L－1标准溶液系列,经0.22μm 滤膜过滤后供HPLC-MS/MS分析。

标准溶液系列2:取适量标准储备溶液,用水逐级稀释,配制成100,200,300,400,500 mg·L－1标准溶液系列,供UV-Vis分析。

柠檬酸盐缓冲液:pH 6.8,取26.0 g 柠檬酸、14.0 g氢氧化钠和78.0 g无水乙酸钠,用500 mL水溶解后转移至1 L 容量瓶中,加入250 mL 正丙醇,用水稀释至刻度,即得pH 6.8柠檬酸盐缓冲液。

氯胺T 溶液:取1.41 g的氯胺T,用100 mL柠檬酸盐缓冲液溶解即得,现用现配。

显色剂:取10.0 g对二甲氨基甲醛,用35 mL 60%(质量分数)高氯酸溶液溶解,然后缓慢加入65 mL异丙醇即得,现用现配。

L-羟脯氨酸标准品的纯度不小于98%;盐酸、柠檬酸钠、硫酸、氯胺T、对二甲氨基苯甲醛、高氯酸和异丙醇等试剂均为分析纯;试验用水为纯水。

试验所用藕鳖共作模式养殖的中华鳖(3 只,725 g±55 g)采自安徽省马鞍山春盛生态农业有限公司(马鞍山),该中华鳖在出壳后,置于室外池塘中养殖至次年5～6月,再转移至种植有莲藕的外塘养殖3 a,其中莲藕种植面积为30%～40%,中华鳖养殖密度为1.5只·m－2;所用温室-外塘两段式养殖的中华鳖(3只,600 g±60 g)采自安徽省喜佳农业发展有限公司(蚌埠),该中华鳖在出壳后,在水温(30±0.5)℃温室内养殖至次年5～6月,再转移至外塘进行标准化养殖2 a,养殖密度为2～3 只·m－2。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 HPLC条件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱温35 ℃;进样体积1μL;流量0.3 mL·min－1;运行时间5 min;流动相A 为0.1%(体积分数,下同)甲酸溶液,B 为乙腈。梯度洗脱程序:0～0.01 min 时,B 为5%;0.01～0.50 min时,B 由5%升 至95%,保 持2.50 min;3.00～3.50 min 时,B 由95% 降 至5%,保 持1.50 min。

1.2.2 MS/MS条件

电喷雾离子源正离子(ESI＋)模式;多反应监测模式;干燥气为氮气,流量10.0 L·min－1;加热气为空气,流量10.0 L·min－1;碰撞气为氩气,压力270 kPa;雾 化气流 量3.0 L·min－1;接口温度200 ℃;DL(脱溶剂管)温度280 ℃;驻留时间150 ms;加热模块温度300 ℃;延迟时间3 ms;接口电压1.0 kV;L-羟脯氨酸母离子质荷比(m/z)132.10;定量、定性离子m/z分别为86.2,68.3,驻留时间均为100 ms,Q1碰撞电压分别为14,15 V,碰撞能量分别为22,14 eV,Q3碰撞电压分别为27,30 V。

1.3 试验方法

中华鳖经断头宰杀后采集裙边部分,用破壁机粉碎后装入密封袋内,于－20 ℃冷冻备用。

1.3.1 HPLC-MS/MS

取鳖裙样品约0.2 g,放入氨基酸专用水解管中,加入6 mol·L－1盐酸溶液10.0 mL。将水解管放入冷冻剂(由食盐与冰块按质量比1∶3混合而成)中冷冻5 min,抽真空并充入氮气,密封后将水解管置于(110±2)℃恒温箱中水解22～24 h。冷却、混匀后开管,用滤纸将水解液过滤至50.0 mL容量瓶中,多次洗涤水解管,洗涤液也过滤至容量瓶中,用水稀释至刻度,混匀。分取1.0 mL 样品溶液,于旋转蒸发仪上旋干,加入柠檬酸钠-盐酸-氢氧化钠缓冲液(pH 2.2)100.0 mL,混匀后以5 000 r·min－1转速离心5 min,取上清液用0.22μm 滤膜过滤,滤液供HPLC-MS/MS分析。

1.3.2 UV-Vis

取鳖裙样品约1 g于50 mL 具塞比色管中,加水10 mL和3 mol·L－1硫酸溶液30 mL,加盖,置于恒温干燥箱中,于105℃水解6 h。趁热将水解产物用滤纸过滤至150 mL三角烧瓶中。分取10 mL于100 mL容量瓶中,用200 g·L－1氢氧化钠溶液将溶液酸度调成中性,用水稀释至刻度。分取4.0 mL待测液于25 mL 比色管中,加入氯胺T 溶液2.0 mL,混匀后于室温放置20 min,加入显色剂2.0 mL,充分混匀后,迅速将比色管放入60 ℃水浴中加热20 min,再在冰水浴中冷却3 min,最后在室温下放置30 min,即可制得样品溶液,将4.0 mL 待测液替换为4.0 mL 水,按照上述步骤制备空白溶液。以空白溶液为参比,在检测波长558 nm 处测量样品溶液的吸光度。

1.3.3 数据处理

以11.1(羟脯氨酸系数)倍羟脯氨酸测定值计算胶原蛋白含量。采用软件SPSS 22.0进行显著性检验,当P≤0.05时表示存在显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线和检出限

按照试验方法分析标准溶液系列1和标准溶液系列2(以水作参比),以羟脯氨酸的质量浓度为横坐标,对应的峰面积(HPLC-MS/MS)或吸光度(UV-Vis)为纵坐标绘制标准曲线。结果显示:两种方法标准曲线线性范围分别为1～100μg·L－1和100～500 mg·L－1,线性回归方程分别为y＝2.204×104x＋6.665×103和y＝3.400×10－4x－1.342×10－2,相关系数分别为0.999 4和0.998 9。

用HPLC-MS/MS分析时,以3倍基线噪声所得信号对应的质量浓度作为羟脯氨酸的检出限,所得结果为0.5μg·L－1;用UV-Vis分析时,以吸光度为0.01 时对应的质量浓度作检出限,结果为63 mg·L－1[15]。

2.2 精密度和回收试验

对实际样品进行加标回收试验,加标量分别为1.3 mg(HPLC-MS/MS)和2.5 mg(UV-Vis),每 种方法均做6个平行样,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)。结果显示,两种方法的回收率分别为94.2%～99.3%和94.0%～98.0%,测定值的RSD 分别为2.2%和2.1%,说明两种方法准确度和精密度均较好。

2.3 样品分析

分别用HPLC-MS/MS和UV-Vis分析两种养殖模式下所得的实际样品。结果显示:温室-外塘两段式养殖的中华鳖鳖裙中胶原蛋白的检出量分别为(15.15±0.54)g/100 g和(14.76±0.27)g/100 g,显著性差异试验所得P值为0.075,说明两种方法不存在显著性差异;藕鳖共作模式养殖的中华鳖鳖裙中胶原蛋白的检出量分别为(17.18±0.92)g/100 g和(17.96±0.10)g/100 g,测定值高于前一种养殖模式的,所得P值为0.011,说明两种方法存在显著性差异。推测主要是由检测仪器的差异造成的,偏差均在合理的范围内。以上结果说明这两种检测方法都能够对胶原蛋白的含量进行有效地检测。

本工作采用UV-Vis和HPLC-MS/MS测定温室-外塘两段式和藕鳖共作模式养殖的中华鳖鳖裙中胶原蛋白的含量,两种方法均能够对羟脯氨酸进行有效检测。UV-Vis操作简单、仪器价格低廉,可在常规实验室广泛推广。UV-Vis样品前处理步骤较多,需要制备空白样[16],而HPLC-MS/MS 前处理相对简单,能连续进样、灵敏度和自动化程度高、可多种氨基酸同时分析,但是仪器价格昂贵、对技术人员要求较高,适用于条件较好的实验室。在实际应用时,可根据实验室自身条件或者检测需求选择检测方法。