广西壮族女性人群中ST K11基因遗传多态性的研究

凌永嫦，仇雯丽，王俊利，吴惠珍

1.右江民族医学院附属医院产科，广西 百色 533000；

2.右江民族医学院，广西 百色 533000

STK11 又被称为肝激酶B1(LKB1)，该基因是肿瘤抑制因子，位于人类染色体19p13.3 上，其细胞功能可通过蛋白质-蛋白质相互作用进行调节，还可通过磷酸化和腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)及其相关激酶的激活影响癌细胞的极性、代谢和增殖[1]。各种癌症可通过基因突变或表观遗传失活来抑制该基因的功能从而促进肿瘤的恶性进展[2]。查阅文献发现，有关STK11 基因的研究主要是以基因表达水平和mRNA为主，其中基因表达水平以遗传多态性多见，有文献报道STK11基因遗传多态性与结直肠癌[3]、糖尿病[4]和帕金森[5]等疾病相关，同时也发现STK11 基因遗传多态性与疾病之间存在区域差异性。目前未发现单纯的STK11 基因遗传多态性分布的有关文献。因此，本文采用imLDR技术检测了广西壮族正常女性人群STK11 基因rs12977689、rs60755851和rs9282860的基因型，并与千人基因组计划数据库中不同国家或地区正常女性人群的数据进行比较，分析STK11基因型和等位基因在不同女性人群中的分布差异，为STK11基因遗传多态性和疾病易感性的研究提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取2018—2020 年在广西右江民族医学院附属医院健康体检中心进行健康体检的壮族正常女性共351 例，年龄(51.57±8.86)岁，所研究人群各项临床检查和实验室指标均正常，且为长期居住在广西地区，无血缘关系，无恶性肿瘤、精神病、慢性病和自身免疫性疾病等。本研究经右江民族医学院附属医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 样本DNA的提取 采集研究对象的空腹静脉血5 mL 于肝素抗凝管，使用深圳亚能公司DNA 提取试剂盒提取外周血DNA，放置-80℃冰箱备用。

1.3 引物合成和基因型检测 STK11基rs12977-689、rs60755851 和rs9282860 位点委托上海天昊生物科技有限公司采用在线Primer3 软件设计合成引物(表1)。采用HotStarTaq(Qiagen 公司)对研究样本DNA进行多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，PCR 反应体系(20 μL)：1×GC-I buffer (Ta-KaRa 公司)，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP，1 U HotStarTaqpolymerase(Qiagen 公司)，1 μL 样本DNA和1 μL 多重PCR 引物。PCR 循环：95℃2 min；11 个循坏(94℃20 s，65℃40 s，72℃1.5 min)；24 个循坏(94℃20 s，59℃30 s，72℃1.5 min)；72℃2 min。多重PCR 产物纯化：在20 μL PCR 产物中加入5 U SAP 酶和2 U Exonuclease I酶，37℃温浴60 min，然后75℃灭活15 min 进行多重PCR 产物纯化。连接反应体系：10×连接缓冲液1 μL、高温连接酶0.25 μL、5′连接引物混合液(1 μmol/L)0.4 μL，3′连接引物混合液(2 μmol/L)0.4μL、纯化后多重PCR 产物2 μL、ddH2O 6 μL 混匀。连接程序：38个循坏(94℃1 min，56°C 4 min)。接着取1 μL 稀释后的连接产物，与0.1 μL Liz500 size standard、9 μ L Hi-Di 混 匀，95℃变 性5 min 后 上ABI3730XL 测序仪，通过毛细管电泳鉴别连接产物。用GeneMapper4.1 (Applied Biosystems，USA)软件进行SNP 基因型分型，最后用Sanger测序法验证。该试验委托上海天昊生物科技有限公司进行。

表1 rs12977689、rs60755851和rs9282860位点的引物信息

1.4 统计学方法 计算基因型和等位基因频率，计数资料以百分率(%)表示。采用孟德尔遗传平衡定律验证研究对象是否具有代表性。使用SPSS24.0 软件进行数据的统计分析，两组间基因型和等位基因分布差异比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。检验水准α=0.05，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 STK11基因rs12977689、rs60755851和rs928-2860 基因型的分型情况 三个位点的基因型均符合孟德尔遗传平衡定律(P=0.373，P=0.199，P=0.344)，说明研究对象具有代表性。结果显示，rs12977689 和rs60755851 的基因型是CC、CA、AA，rs9282860 的基因型是CC、CT、TT。Sanger 测序法验证基因型结果，三个位点的测序图见图1。

图1 rs12977689、rs60755851 和rs9282860测序图

2.2 STK11 基 因rs12977689、rs60755851 和rs9282860 位点多态性的分布情况 rs12977689 基因型CC、CA、AA 的频率分别为51.0%、44.2%、6.8%，等位基因C、A 频率分别为72.1%、27.9%，rs60755851 基因型AA、CA、CC频率分别为37.3%、50.2%、12.5%，等位基因A、C 频率分别为62.4%、37.6%。rs9282860 基因型CC、CT、TT 频率分别为70.9%、27.4%、1.7%，等位基因C、T 频率分别为84.6%、15.4%，见表2。rs12977689、rs60755851 和rs9282860 多态性位点均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)，表明所选群体符合孟德尔遗传平衡定律(P=0.373，P=0.199和P=0.344)，见表2。

表2 广西壮族正常女性人群rs12977689、rs60755851、rs9282860的分布[例(%)]

2.3 STK11基因rs12977689、rs60755851和rs928-2860 位点多态性与不同人群比较 广西壮族正常女性人群rs12977689和rs60755851的基因型和等位基因分布频率与非洲、美国、欧洲、南亚以及印度的正常女性比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)，与日本的正常女性比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3、表4。广西壮族正常女性rs60755851 位点的基因型与北京汉族正常女性比较差异有统计学意义(P＜0.05)，而等位基因频率差异无统计学意义(P＞0.05)，见表4。广西壮族正常女性rs9282860 的基因型和等位基因频率与非洲、日本和欧洲的正常女性比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表5。

表3 rs12977689在不同女性人群的分布频率[例(%)]

表4 rs60755851在不同女性人群的分布频率[例(%)]

表5 rs9282860在不同女性人群的分布频率[例(%)]

3 讨论

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因组中的单个核苷酸在成对染色体中不同时发生的DNA序列变异，它代表了人类基因组中最常见且重要的变异类型。这些简单的变化可以是转换或颠换类型，它们以大约千分之一的频率发生在整个基因组中。编码区的某些SNP 会改变蛋白质的氨基酸序列，而编码区的其他SNP 不会影响蛋白质序列；非编码区的SNP 也可能影响转录因子结合，基因剪接或信使RNA(mRNA)降解。总之，编码区或非编码区的SNP 都可能会影响启动子活性(基因表达)、mRNA构象(稳定性)以及mRNA和/或蛋白质的亚细胞定位，从而导致相关疾病发生[6]。SNP在种群遗传学和医学研究中都非常重要，近年来大量研究表明基因多态性对疾病易感性起着重要的作用，可作为疾病的病因和发病危险因素，也可作为某些疾病的遗传标记。查阅国内外文献，发现有关STK11基因的研究主要是以基因表达水平和mRNA为主，其中基因表达水平以遗传多态性多见。有研究发现，STK11的rs8111699位点的SNP与帕金森病和西班牙妇女的妊娠期糖尿病有关[5，7]，而ALHARBI 等[8]发现rs8111699 位点的SNPs 与沙特妇女的妊娠糖尿病无关。目前未发现关于STK11基因多态性在广西壮族人群分布情况的文献报道。因此，本研究进一步分析了STK11基因其他常见SNPs位点在不同国家或地区正常女性人群中的分布差异，这将有助于探讨不同地区人群遗传多态性与疾病易感性的差异，为疾病的诊疗和预后提供临床思路。

本研究结果表明，广西壮族正常女性人群中rs12977689和rs60755851位点存在CC、CA和AA 三种基因型；而rs9282860 存在TT、TC 和CC 三种基因型。这三个位点均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。广西壮族正常女性人群的rs12977689和rs60755851的基因型和等位基因分布频率与非洲、美国、欧洲、南亚和印度的正常女性比较差异有统计学意义，与日本的正常女性比较差异无统计学意义；广西壮族正常女性rs60755851位点的基因型与北京汉族正常女性比较差异有统计学意义；广西壮族正常女性rs9282860 基因型和等位基因分布频率与非洲、日本和欧洲地区的正常女性人群比较差异有统计学意义。出现以上结果的原因：首先，广西与非洲、美国、欧洲、南亚、印度等地区由于种族文化、地域差异、居住环境、遗传背景、生活习惯等多种因素影响，且无亲缘关系，故遗传多态性差异也大。其次，日本与中国相邻，地域差异相对小，故基因遗传多态性差异不明显。因此，广西壮族正常女性rs12977689和rs60755851位点的遗传多态性与日本正常女性比较无差异或差异相对小；但在rs9282860 位点却有差异，这可能与遗传背景、居住环境和种族不同有关。除此之外，广西壮族和北京汉族属于同一种族，按亲缘关系，遗传多态性本应无差异，但在rs60755851 位点却存在差异性，考虑可能是壮族和汉族人群遗传背景不同，也可能是少数民族居住地的环境、生活习惯不同所致。有研究表明，中国汉族2型糖尿病患者中STK11 基因rs12977689 等位基因A携带者的冠心病发病风险明显高于非携带者[9]。BOULLERNE 等[10]研究发现rs9282860 位点的SNP 在多发性硬化症的女性患者中频率增加；接着还发现rs9282860 位点的SNP 在非裔美国人继发性进行性多发性硬化症患者中患病率最高，并且在该队列中，SNP与出现症状和诊断时的年龄较大有关，可影响早期发病和病情进展，是该人群中继发性进行性多发性硬化症的一个危险因素[11]。目前关于这三个位点与疾病易感性研究的文献相对少，但以上的研究结果表明，STK11 基因遗传多态性与疾病易感性存在差异，为今后研究STK11 基因多态性与不同国家或地区人群疾病易感性的关系提供理论基础。

综上所述，本研究发现广西壮族正常女性人群与其他国家或地区正常女性人群中rs12977689、rs60755851和rs9282860 位点的遗传多态性存在差异，由此可推测不同国家或地区由于遗传背景、种族文化和居住环境不同，对疾病易感性也有所差异。但本研究仍存在一定的局限性：(1)纳入的病例数量少，且未能剔除环境因素的影响；(2)本研究对象为本地区壮族女性，无法完整反映真实情况，因此对基因多态性的研究需扩大研究对象来源和选择更多SNP位点。