FCGR3A和FCGR3B基因拷贝数变异对HBV感染转归的影响

李昊天， 王同同， 李绪桐， 郜玉峰

安徽医科大学第一附属医院 感染病科， 合肥 230022

HBV感染后的临床转归与病毒、宿主免疫及宿主遗传因素密切相关[1]，慢性HBV感染可诱导体内固有免疫和特异性免疫反应，常伴有肝损伤和炎症[2]。由病毒复制引起的持续或反复的炎症增加了慢性乙型肝炎(CHB)发展为肝衰竭甚至肝癌的风险[3]。目前对HBV感染机制的认识还存在许多不足，其结果受多种因素的影响，包括自我限制的消除或持续耐受。除了与病毒本身、宿主的免疫反应、年龄和性别有关外，越来越多的证据[4-5]表明人类遗传变异中拷贝数变异(copy number variant，CNV)可能在HBV感染慢性化中起作用。以往综合分析的研究[6]表明，IgG Fcγ受体(FcγR)的表达与HBV感染的不同免疫阶段有关。FcγRⅢA和FcγRⅢB编码的免疫球蛋白G Fc段受体Ⅲa(Fc gamma receptors 3A，FCGR3A)和免疫球蛋白G Fc段受体Ⅲb(Fc gamma receptors 3B，FCGR3B)基因位于CNV的染色体1q23.3位点，这个位点可改变相应受体的表达和对抗原的免疫效力[7-8]。免疫细胞上活化的FcγRⅢ可参与调节一系列免疫应答，如清除免疫复合物和抗体依赖的细胞毒性作用，并进一步促进炎症反应[9]。在复杂的免疫过程中产生的促炎细胞因子进一步影响HBV感染的结果[10]。FCGR3A和FCGR3B基因 CNV是否通过改变基因表达水平从而影响HBV感染后的转归尚不清楚。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2014年1月—2018年12月安徽医科大学第一附属医院和第二附属医院感染病科住院和门诊慢性HBV感染患者841例，其中CHB患者444例，肝硬化(LC)274例，肝细胞癌(HCC)123例。另外再纳入性别、年龄、种族相匹配的296例自限性HBV感染者。所有病例诊断均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[11]。慢性HBV感染的诊断标准：HBsAg阳性6个月以上。自限性HBV感染者的入选标准：抗-HBc和抗-HBs阳性，HBsAg阴性，血清ALT水平正常，HBV DNA低于检测下限，且均未接种乙型肝炎疫苗。排除标准：酒精或非酒精性因素所致脂肪肝、自身免疫性肝病、合并HIV或其他嗜肝病毒感染(甲、丙、丁、戊)、不明原因肝功能障碍及其他严重全身性疾病。

1.2 观察指标 采集患者的年龄、性别、实验室指标。实验室指标包括ALT、AST、HBV DNA、HBeAg等指标。使用bs330全自动生化分析仪检测ALT(正常范围9～50 U/L)、AST(正常范围15～40 U/L)；在ABI7500荧光定量PCR仪上使用HBV DNA定量检测试剂盒进行HBV DNA的检测；HBV DNA检测下限为500 IU/mL。采用酶联免疫吸附剂测定(ELISA)检测HBV血清学指标。

1.3 基因组DNA的提取和CNV的检测 每位患者采集5 mL全血置于抗凝管中。根据QIAGEN试剂盒(QIAGEN, Hilden, Germany)的说明书进行基因组DNA提取，提取后置于-80 ℃保存，用于后续的DNA基因型检测。FCGR3的基因拷贝数采用AccuCopy试剂盒(上海天昊生物科技有限公司)进行定量，采用文献[12]报道的方法，合成FCGR3特异性引物和竞争模板(表1)，根据要求将一定量的竞争DNA与适量样本DNA混匀，进行多重荧光竞争性PCR扩增，采用毛细管电泳法分离DNA片段，采用 GeneMapper 4.0软件分析。通过目的基因与内参基因S/C值比较，进行均一化处理，得到FCGR3基因拷贝数。以上实验重复3次，以保证实验的准确性和真实性。

表1 FCGR3A和FCGR3B基因扩增引物

2 结果

2.1 两组HBV感染者基线特征比较 慢性HBV感染组平均(44.11±15.87)岁，自限性HBV感染组平均(42.13±15.27)岁；两组男女性别比分别为673∶168和224∶72，两组年龄(t=1.870,P=0.062)、性别(χ2=2.486,P=0.115)差异均无统计学意义。

依据HBV慢性感染后不同疾病进展状态将患者分为CHB组、LC组和HCC组。3组间性别差异无统计学意义(P=0.180)，年龄、ALT、AST、HBeAg差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表2)。

表2 慢性HBV感染者不同分组的基线特征

2.2 两组HBV感染者FCGR3A和FCGR3B拷贝数的分布 对841例慢性HBV感染者和296例自限性HBV感染者的FCGR3A和FCGR3B基因 CNV进行定量分析。将得到的拷贝数量化后，受试者的频率分布范围为2～8拷贝。CNV的中位数为4拷贝，对于FCGR3A, 4拷贝在慢性HBV感染组和自限性HBV感染组中的比例分别为65.5%和62.2%，而FCGR3B分别为64.5%和62.9%(表3)。

表3 两组HBV感染者FCGR3A和FCGR3B拷贝数分布情况

2.3 两组HBV感染者FCGR3A和FCGR3B基因拷贝数的分布频率比较 根据CNV的中位数将所有样本分为低拷贝(≤3)、中拷贝(=4)和高拷贝(≥5)三类。分析显示，FCGR3A基因CNV在慢性HBV感染组和自限性HBV感染组之间的频率分布有显著性差异(χ2=11.406，P=0.003)，这与FCGR3B一致(χ2=19.143，P<0.001)(表4)。

表4 两组HBV感染组FCGR3A和FCGR3B拷贝数分布频率差异

2.4 慢性HBV感染组不同疾病进展阶段患者FCGR3A和FCGR3B基因拷贝数分布频率比较 CHB组、LC组、HCC组中FCGR3A、FCGR3B CNV分布频率差异无统计学意义(表5)。HBeAg血清转换与否与机体的免疫功能密切相关，将所有慢性HBV感染者按照HBeAg状态进行分为阳性组和阴性组，比较FCGR3基因CNV在两组间的分布差异，结果显示，FCGR3基因CNV在HBeAg阳性组和阴性组之间没有统计学差异(P值均>0.05)(表6)。

表5 慢性HBV感染组不同疾病进展患者FCGR3基因拷贝数分布频率比较

表6 慢性HBV感染组不同HBeAg状态患者FCGR3 基因拷贝数分布频率比较

2.5 FCGR3 CNV在慢性HBV感染后转归中的作用 将年龄、性别、拷贝数作为自变量，患者HBV感染后的转归(急性/慢性)作为因变量，进行logistic回归分析。其中FCGR3A基因和FCGR3B基因拷贝数减少或缺失增加HBV感染者慢性化的风险，OR及(95%CI)分别为0.621(0.513～0.752)、0.594(0.491～0.719)，结果提示FCGR3A基因和FCGR3B基因拷贝数目减少或缺失是HBV感染慢性化的危险因素(表7)。

表7 FCGR3A和FCGR3B CNV与慢性HBV感染后转归的关系

3 讨论

CNV可以造成宿主基因拷贝数的改变，并通过基因序列位置的改变影响基因的表达，并进一步影响疾病的易感性和疾病进展[13]。越来越多的报道[14-16]证明CNV在人类感染和自身免疫性疾病中起着至关重要的作用，包括HIV-1感染、系统性红斑狼疮和溃疡性结肠炎。既往研究[17]表明CNV影响HBV感染的结果。慢性HBV感染可诱导体内固有免疫和特异性免疫反应，FCGR3基因编码的FcγRⅢ可介导固有免疫和适应性免疫的多种免疫功能。在一些自身免疫性疾病和炎症性疾病中已经检测到FCGR3 CNV，但其在HBV感染中的特异性作用尚不十分清楚。

既往研究[18]表明，FcγR介导的抗体效应功能在病毒持续感染过程中受损或被抑制。Jin等[6]发现HBV感染免疫耐受期FcγRⅢB的表达低于清除期的表达，免疫耐受阶段可能会导致病毒感染的持续存在。此外，血清IgG水平升高是慢性感染性疾病的临床特征，与疾病进展密切相关[19]。FCGR识别并结合免疫复合物(immune complexs，IC)，这是由IgG抗体与其同种抗原结合形成的。Willcocks等[20]证实了FCGR3B CNV与受体的表达和IC的摄取之间的显著相关性。另一项研究[21]证实，FCGR3B基因表达降低与循环IC清除率降低有关，这将促进炎症性疾病的发展。本研究通过对HBV感染后不同转归患者外周血FCGR3基因的CNV分析发现，自限性HBV感染组与慢性HBV感染组之间在FCGR3基因拷贝数分布频率上存在差异，与自限性HBV感染组相比，慢性HBV感染组FCGR3A基因和FCGR3B基因的拷贝数减少或缺失的比例更高，差异有统计学意义。本文因纳入因素有限，模型拟合度较低(FCGR3A：R2=0.038，FCGR3B：R2=0.045)，但研究模型分析对疾病的转归和病程进展具有一定的价值。

在HBV感染不同免疫状态的基因和通路研究中，荧光定量PCR分析发现免疫清除期患者FcγRⅢA和FcγRⅢB的表达水平明显高于免疫耐受期HBV感染者和健康对照[6]。一般来说，免疫清除期反映了对HBV的免疫应答[22]，FcγRⅢA可以通过免疫受体酪氨酸基活化基元(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)诱导细胞信号转导，ITAM与FcγR链有关，当IgG浓度达到一定水平时，ITAM以一种特殊的构象传导抑制信号，阻止炎症细胞浸润和炎症介质产生，这有助于控制炎症疾病的发生发展[23-24]。对于FcγRⅢB，认为另一种可能的机制是FCGR3B的高拷贝数和具有抗炎活性的循环可溶性FcγR水平升高之间存在相关性[20]。

综上所述，FCGR3A基因和FCGR3B基因拷贝数目减少或缺失是HBV感染慢性化的遗传易感因素之一，但与疾病进展无关。FCGR3基因CNV在HBV感染中的具体机制值得进一步探讨。由于本研究仅涉及中国汉族患者，这些发现是否与其他民族慢性HBV感染的结果一致有待进一步研究。

伦理学声明：本研究于2012年2月18日通过安徽医科大学生物医学伦理委员会审核批准，批号：2012102。所有患者均签署知情同意书。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：李昊天、王同同负责实验和数据分析及文稿撰写；李绪桐负责数据收集及文献检索；郜玉峰负责文稿的构思、润色和最后定稿。