两种抗人T 淋巴细胞免疫球蛋白原料和成品中淋巴细胞毒效价检测方法的相关性分析

邹浩勇，薛红刚，殷文曲，程文进，余健，王智，郭晓东，张智

武汉中生毓晋生物医药有限责任公司，湖北 武汉 430207

抗人 T 淋巴细胞免疫球蛋白（ALG ／ ATG）药物是一种多抗生物治疗抑制剂，其适应症较广泛，主要用于再生障碍性贫血、器官移植、自身免疫系统疾病等的治疗［1］。该产品主要通过收集大量由胸腺或T淋巴细胞免疫的各种动物（马、兔、猪或山羊）含特异性抗体的血浆，并进行纯化后制备［2］，可通过多种途径对免疫系统进行调节［3］。ATG 通过破坏淋巴细胞发挥其免疫抑制作用，主要机制可能是通过激活诱导细胞凋亡、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，以及补体依赖的细胞毒作用来清除体内的T 细胞［3-7］。生物测定可直接评估生物活性产品的生物活性，是确保生物制品中药物活性的关键质量参数［8］。

《欧洲药典》和《英国药典》早已通过流式细胞术测定ATG 产品的淋巴细胞毒效价［9-11］，而《中国药典》四部（2020 版）［12］仍采用传统人工计数淋巴细胞毒试验的方法，其人为因素较多，结果差异也较大。因此，本研究借鉴《欧洲药典》和《英国药典》的流式细胞术检测方法，建立一种适合ATG 原料和成品中淋巴细胞毒效价的流式细胞术检测方法，并与传统人工计数淋巴细胞毒试验方法进行相关性分析，以期为我国抗人T 淋巴细胞免疫球蛋白产品质量的提升奠定基础。

1 材料与方法

1.1 血浆及血液 免疫后猪血浆由本公司提供；人外周血由本公司人员捐献。

1.2 实验动物 普通级日本大耳白兔，3 ~ 4月龄，雌雄不限，体重2.0 ~ 2.5 kg，由本公司动物室提供。动物合格证号为SYXK（鄂）2018-0099。本实验均以科研为目的对兔子进行养殖和使用，且按照动物伦理相关规定进行（WIBP-AIIYJ2020001）。

1.3 主要试剂 PI 试剂和PBS 由湖北赛维尔生物科技有限公司提供；胎牛血清购自美国GIBCO 公司；Hank’s 液购自武汉Procell 公司；淋巴细胞分离液购自福建三一造血技术有限公司猪抗人T 淋巴细胞免疫球蛋白成品由本公司制备。

1.4 样品及溶液的制备

1.4.1 供试品溶液的稀释 将人外周血免疫后的猪血浆60 ℃加热10 min，用生理盐水稀释至1 ∶500、1 ∶1 000 后待检。

1.4.2 阴性对照样品 免疫前的猪血浆60 ℃加热10 min，用生理盐水稀释10 倍后备用。

1.4.3 阳性对照样品 将人T 淋巴细胞免疫后的猪血浆60 ℃加热10 min，用生理盐水稀释10 倍后备用。

1.4.4 淋巴细胞悬液 取新鲜人外周血15 mL，用淋巴细胞分离液分离人外周血淋巴细胞，用含20%胎牛血清的 Hank’s 液稀释为 5 × 106个 ／ mL。

1.4.5 兔补体 按照《中国药典》规定，筛选用于检测的兔补体，用生理盐水稀释5 倍后备用。

1.4.6 PI 染色液 用含2%胎牛血清的PBS 将PI 稀释至 5 μg ／ mL，2 ~ 8 ℃保存，3 h 内使用。

1.5 猪血浆中淋巴细胞毒效价的检测

1.5.1 《中国药典》方法 采用《中国药典》中的淋巴细胞毒试验方法。判定标准：阳性对照组的淋巴细胞死亡率＞20%，且阴性对照组的淋巴细胞死亡率 ＜10%，试验成立；试验组的淋巴细胞死亡率 ＜10%为阴性（-），10% ~ 20%为可疑（±），＞ 20%为阳性，其中 21% ~ 40%为（+），41% ~ 60%为（），61% ~ 80%为（），≥ 81%为（）。

1.5.2 流式细胞术 前期步骤均按照《中国药典》方法，最后将台盼蓝染色换为PI 染色后上流式细胞仪检测。取供试品阳性、阴性样品溶液各0.05 mL，加入淋巴细胞悬液0.05 mL，37 ℃反应1 h；加入稀释好的兔补体0.05 mL，37 ℃反应30 min；制冷离心机 800 × g 离心 8 min，弃上清，加入 200 μL PI 溶液，常温下反应10 min，立刻置于冰上，上流式细胞仪检测（由第三方检测公司湖北塞维尔生物技术有限公司，使用贝克曼CytoFLEX 检测）。判定标准同1.5 项。并与《中国药典》方法进行相关性分析。

1.6 猪抗人T 淋巴细胞免疫球蛋白成品中淋巴细胞毒效价的检测 分别采用1.5 项中的两种方法检测3 批猪抗人T 淋巴细胞免疫球蛋白成品。

1.7 统计学分析 应用SPSS 17.0 统计学软件，分析两种检测方法之间以及同种检测方法不同稀释倍数之间结果的相关性。以相关系数（r）＞0.5，P ＜0.05 为显著相关；r ＞ 0.5，P ＜ 0.01 为极显著相关。

2 结 果

2.1 猪血浆中淋巴细胞毒效价的检测

2.1.1 《中国药典》方法 检测结果显示，阳性对照细胞死亡率为42%，阴性对照细胞死亡率为1%，阳性对照和阴性对照均成立。人外周血T 淋巴细胞免疫的17 份猪血浆样品在500 倍稀释时有8 份不合格，其中1 份为阴性，7 份为可疑，合格率为52.9%；1 000 倍稀释时合格率更低，仅为17.6%，其中3 份合格，11 份可疑，3 份为阴性。见表1。

表1《中国药典》方法检测猪血浆样品淋巴细胞毒试验结果Tab.1 Lymphocytotoxicity test of porcine plasma samplesby method in Chinese Pharmacopoeia

2.1.2 流式细胞术 检测结果显示，阴性对照组（10 倍稀释）平均PI+低于10%，阳性对照组（10 倍稀释）平均PI+为92.3%，二者均成立，见图1 和表2。其中图1E 的人外周血淋巴细胞对照不进行PI染色。

表2 阳性对照组和阴性对照组流式细胞术检测结果Tab.2 Results of flow cytometry in positive and negative control groups

图1 流式细胞术分析阴性对照（A、B）、阳性对照（C、D）、人外周血淋巴细胞（E）Fig.1 Flow cytometry of negative controls（A，B），positive controls（C，D）and human peripheral blood lymphocytes（E）

17 份猪血浆样品在500 倍稀释时合格率为100%，1 000 倍稀释时有1 份不合格，合格率为94.1%，见表3。与2.1.1 项相比，流式细胞术检测结果的合格率远高于人工检测结果。

表3 流式细胞术检测猪血浆样品淋巴细胞毒试验结果Tab.3 Flow cytometry of lymphocytotoxicity of porcine plasma samples

2.2 猪抗人T 淋巴细胞免疫球蛋白成品中淋巴细胞毒效价的检测

检测结果显示，两种方法检测阳性对照和阴性对照均成立，见表4；用《中国药典》方法检测3 批猪抗人T 淋巴细胞免疫球蛋白成品的结果比流式细胞术检测结果低，但两种方法的趋势一致，见表5。

表4 两种方法检测猪抗人T 淋巴细胞免疫球蛋白成品对照组结果Tab.4 Determination results of final product of porcine antihuman T lymphocyte immunoglobulin by two methods in control group

表5 两种方法检测猪抗人T 淋巴细胞免疫球蛋白成品结果（%）Tab.5 Determination results of final product of porcine antihuman T lymphocyte immunoglobulin by two methods（%）

2.3 两种方法检测结果的相关性 相关性分析结果显示，两种检测方法之间以及同种检测方法不同稀释倍数之间结果均显著相关，其中500 倍稀释极显著相关。流式细胞术不同稀释倍数之间的r（0.919）明显高于《中国药典》方法（0.737），表明流式细胞术检测结果差异性更小，结果更准确，见表6。3 批成品不同稀释倍数时两种方法的检测结果r 为0.910，P 为0.000 7，表明两种方法也极显著相关。

表6 两种方法检测结果的皮尔逊相关性分析（r）Tab.6 Pearson correlation analysis of determination results by two methods（r）

3 讨 论

流式细胞术是 20 世纪 70年代初发展起来的一项高新技术，集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，是对快速直线运动状态中的细胞、生物颗粒或液体中的大分子物质进行多参数、快速、定性、定量分析和分选的一种技术［13-15］。本研究主要采用流式细胞术进行淋巴细胞毒试验，结果显示，简易的流式细胞术与传统的《中国药典》方法检测结果具有相关性，且流式细胞术的不同稀释倍数检测结果之间的r 比《中国药典》方法高，表明流式细胞术的检测结果更准确。同时，采用两种方法检测成品的结果也显示二者之间存在极显著的相关性，表明该简易流式细胞术可行。

流式细胞术用仪器可分析4 500 个以上细胞，比人工计数（100 个细胞）高出40 倍以上。从概率上，流式细胞术的检测结果更准确、差异更小；而人工计数100 个细胞的死亡率，细胞占比太小，且存在观察视野不同结果不同的情况，人为误差较大。原料检测合格率结果显示，《中国药典》检测方法合格率较低，也间接证实了该结论。从风险和经济上分析，因原料的生产周期较长，生产成本也较高，检测结果的误差会对产品原料的生产造成不利影响，增加产品供应商的风险和成本，从而间接造成产品原料的短缺。因此，本研究建立的简易流式细胞术提高了检测方法的准确性，有利于产品原料的检定，具有一定的应用价值。