基于血管紧张素转换酶2 受体表达的SARS-CoV-2 假病毒中和活性检测方法的建立及验证

田莎莎，王建华，孙百平，余飞，刘万卉

1.烟台大学药学院，山东 烟台 264005；2.山东博安生物技术有限公司，山东 烟台 264003

2019 新型冠状病毒病（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）是一种由新型冠状病毒引起的病毒性肺炎［1-3］，国际病毒分类委员会将其命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）［4］。截至 2021年9月1日，全球已确诊2 175 万例COVID-19，严重威胁人类健康和社会稳定，亟需研发相应治疗药物和疫苗［5-6］。抗体能识别特定的病原微生物，阻止其入侵体内，因此抗体活性检测是确保疫苗有效性的重要质控指标之一。针对极高生物安全要求的SARS-CoV-2 活病毒，有研究通过在包装细胞内转染SARS-CoV-2 的包膜蛋白（spike 蛋白），再用去除包膜蛋白基因的水疱性口膜炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）作为假病毒感染包装细胞，使包装细胞产生具有SARSCoV-2 包膜蛋白的VSV 颗粒，可部分模拟胞膜病毒侵染细胞及与受体结合等过程［7］。病毒利用高度糖基化的同源三聚体S 蛋白进入宿主细胞，S 蛋白经多种结构重新排列后将病毒融合进入宿主细胞的细胞膜，S1 亚基结合至宿主细胞血管紧张素转换酶 2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）受体，引发三聚体不稳定，S1 亚基脱落，S2 亚基形成高度稳定的融合后结构［8］；S1 亚基中的受体结合结构域（receptor binding domain，RBD）经类似铰链的构象移动隐藏或暴露其受体结合的关键位点［9-10］，与细胞受体ACE2 直接结合，S 蛋白随即启动一系列变异机制，诱导病毒进入宿主细胞［11-12］。

Huh-7 细胞系和 HEK293T-hACE2 细胞系对VSV 假病毒具有高敏感性，其无假病毒感染的细胞背景值低且可产生较高的信号，从而可更好地评估细胞体外活性检测结果［13］。本研究通过在基因和蛋白水平从Huh-7 细胞系和HEK293T-hACE2 细胞系中筛选出ACE2 受体表达量较高的细胞，建立一种基于ACE2 受体表达的SARS-CoV-2 假病毒中和活性的检测方法，并进行验证，以期应用于新冠抗体类药物早期筛选及研发过程中的质量控制。

1 材料与方法

1.1 细胞及毒株 市售Huh-7 细胞分别购自A、B、C 厂家；HEK293T-hACE2 细胞购自四川阿帕克生物科技有限公司；假病毒Wuhan-Hu-1 株、拉姆达、德尔塔变异株均购自北京三药科技开发公司。

1.2 主要试剂及仪器 SARS-CoV-2 抗体参考品［14］及重组抗RANKL 人源化全单克隆抗体购自山东博安生物技术股份有限公司；DMEM、胎牛血清（FBS）和0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco 公司；S1-biotin 抗体购自北京义翘神州科技有限公司；Prime Script RT reagent Kit 逆转录试剂盒和DL2000 DNA marker 购自日本 TaKaRa 公司；SPAR Keasy 组织 ／ 细胞 RNA快速提取试剂盒（Spark Jade）及Fast Start Universal SYBR Green Maste（rROX）荧光染料购自瑞士Roche公司；6×DNALoadingBuffer 购自美国TransgenBiotech公司；FITC anti-human IgG Fc 购自美国Invitrogen公司；Britelite plus 显色液购自美国PerKinelmer 公司；NovoCyte 2060R 流式细胞仪购自艾森生物（杭州）有限公司；U 型底96 孔板购自美国Thermo Scientific公司。

1.3 细胞培养 将Huh-7 细胞用含10%胎牛血清的 DMEM，于 37 ℃，5% CO2条件下培养约 2 d，按1 ∶8 的比例进行传代；将 HEK293T-hACE2 细胞用含10%胎牛血清和 3 μg ／ mL 嘌呤霉素的 DMEM，于37 ℃，5% CO2条件下培养约 2 d，按 1 ∶6 的比例进行传代。

1.4 细胞中ACE2 受体蛋白表达及mRNA 转录水平检测

1.4.1 ACE2 受体蛋白的表达水平 采用流式细胞术。取第15 代对数生长期的Huh-7 及HEK293T-hACE2 细胞，加入0.25%胰酶消化，调整细胞浓度为 2 × 106个 ／ mL，加入 U 型底 96 孔板，50 μL ／ 孔，加入 S1-biotin 抗体至终浓度为 5 μg ／ mL，于 4 ℃静置 1 h；加入 PBS 重悬细胞，200 × g 离心 2 min，弃上清；加入 FITC anti-human IgG Fc（1 ∶100 稀释），100 μL ／ 孔，混匀，于 4 ℃避光孵育 30 min；加入 PBS重悬细胞，置流式细胞仪中检测。

1.4.2 ACE2 受体基因mRNA 的转录水平 采用qPCR 相对定量法。根据GenBank 中登录的ACE2 受体（59272）及 GAPDH 基因序列（2597），应用 Primer 5软件设计引物，ACE2 受体上游引物：5′-CAAGAGCAAACGGTTGAACAC-3′，下游引物：5′-CCAGAGCCTCTCATTGTAGTCT-3′；GAPDH 上游引物：5′-GACCTGCCGTCTAGAAAAAC-3′，下游引物：5′-TTGAAGTCAGAGGAGACCAC-3′。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。用SPAR Keasy 组织 ／ 细胞RNA快速提取试剂盒提取Huh-7 及HEK293T-hACE2 细胞RNA，逆转录合成cDNA，以其为模板，进行PCR扩增。PCR 反应体系为：Master Mix（2 ×）25 μL，上下游引物（100 nmol ／ L）各 0.5 μL，dNTP Mix 5 μL，ddH2O 补足体系至 50 μL。PCR 反应条件为：95 ℃预变性 15 s；95 ℃变性 10 s，60 ℃退火 30 s，共 40 个循环；95 ℃变性 15 min，60 ℃退火 1 min，95℃ 15 s。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，采用Ct 差值比较法 2-△△Ct计算 ACE2 受体基因 mRNA 的转录水平。

1.5 方法的建立 将SARS-CoV-2 抗体参考品加至96 孔板，50 μL ／ 孔，进行 3 倍梯度稀释，共 8 个稀释浓度，每个浓度设2 个复孔，同时设阴性对照孔（仅加入含10% FBS 的DMEM）和空白对照孔；用含10% FBS DMEM 稀释假病毒 Wuhan-Hu-1 株，加入96 孔板中，50 μL ／ 孔，于 37 ℃，5% CO2培养箱孵育1 h；加入筛选出的ACE2 受体表达量较高的细胞，100 μL ／孔，继续培养 20 ～ 28 h；加入显色液 Britelite plus，100 μL ／ 孔，避光反应 2 ～ 3 min，用酶标仪测定化学发光的相对光单位值，并按下式计算抑制率。

抑制率（%）＝1 -［（试验组相对光单位值- 空白对照孔相对光单位值）／（阴性对照孔相对光单位值- 空白对照孔相对光单位值）］× 100%

1.6 方法的优化

1.6.1 病毒滴度及细胞浓度的确定 将SARSCoV-2 抗体参考品稀释为 20 nmol ／ L，加入 96 孔板。将滴度为 1.3 × 105TCID50／ mL 的假病毒稀释为 1 × 104TCID50／ mL 时，细胞浓度分别设为5 × 104、1× 105、4× 105个 ／mL；病毒滴度稀释为1.3×104TCID50／ mL 时，细胞浓度设为 1 × 105、2 × 105、4 × 105个 ／mL；病毒滴度稀释为2.6 × 104TCID50／mL时，细胞浓度设为 5 × 104、1 × 105、4 × 105个 ／ mL。其他步骤同1.5 项。每个组合均设2 个复孔。

1.6.2 抗体浓度的确定 将SARS-CoV-2 抗体参考品稀释为 100 和 667 nmol ／ L，加入 96 孔板，采用最佳病毒滴度和细胞浓度进行检测，其他步骤同1.5 项。

1.7 方法的验证

1.7.1 准确性 将 15 μg ／ mL 浓度设定为 100%，用含10% FBS 的DMEM 将 SARS-CoV-2 抗体参考品稀释为 150%、130%、100%、70%、50% 5 个相对活性浓度，采用建立的方法进行检测，每个浓度独立检测3 次，计算平均抑制率及平均回收率。

1.7.2 线性范围 以SARS-CoV-2 抗体参考品的150%、130%、100%、70%、50% 5 个相对活性浓度为横坐标，1.7.1 项中假病毒中和活性检测结果为纵坐标进行线性拟合，获得拟合方程，建立线性回归曲线。

1.7.3 精密性

1.7.3.1 重复性 采用建立的方法检测150%、100%和50% 3 个相对活性浓度的SARS-CoV-2 抗体参考品，试验重复3 次，计算CV。

1.7.3.2 中间精密性 由2 名实验员（A 和B）采用建立的方法检测150%、100%和50% 3 个相对活性浓度的SARS-CoV-2 抗体参考品，每人均重复检测3 次，计算CV。

1.7.4 专属性 取SARS-CoV-2 抗体参考品、重组抗RANKL 人源化全单克隆抗体及制剂缓冲液，采用建立方法进行检测。

1.8 建立的方法在SARS-CoV-2 变异株中的应用 将建立方法中的假病毒Wuhan-Hu-1 株更换为假病毒拉姆达和德尔塔变异株，验证建立方法对SARS-CoV-2变异株的适用性。

2 结 果

2.1 细胞中ACE2 受体蛋白表达及基因mRNA 转录水平

2.1.1 ACE2 受体蛋白的表达水平 HEK293T-hACE2、Huh-7（A）、Huh-7（B）和 Huh-7（C）细胞中ACE2 受体蛋白表达水平分别为96.2%、3.45%、0.55%、0.81%，HEK293T-hACE2 细胞的表达水平最高，见图1。

图1 各细胞中ACE2 受体蛋白表达水平检测的流式散点图Fig.1 Flow scatter diagram of expression levels of ACE2 receptor protein in various cells

2.1.2 ACE2受体基因mRNA 的转录水平 HEK293T-hACE2、Huh-7（A）、Huh-7（B）和 Huh-7（C）细胞中 ACE2受体基因mRNA 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见157 bp 的目的条带，大小与预期一致，转录水平分别为 100%、0.055%、0.003 92%和 0.001 94%。HEK293T-hACE2 细胞远高于Huh-7 细胞。见图2。因此，选用HEK293T-hACE2 细胞用于后续试验。

图2 qPCR 相对定量法检测ACE2 受体基因mRNA 的转录水平Fig.2 Determination of ACE2 receptor mRNA transcription by qPCR

2.2 方法的优化

2.2.1 最佳病毒滴度及细胞浓度 病毒滴度为1 ×104和 1.3 × 104TCID50／ mL 时，曲线点浮动较大，结果均不稳定。病毒滴度为 2.6 × 104TCID50／ mL，细胞浓度为 4 × 1054个 ／ mL 时，曲线点浮动较小，结果最优，见图3。因此，确定最佳病毒滴度为2.6 ×104TCID50／ mL，细胞浓度为 4 × 1054个 ／ mL。

图3 病毒滴度和细胞浓度的优化Fig.3 Optimization of virus titer and cell concentration

2.2.2 最佳抗体浓度 抗体浓度为100 nmol ／ L 时，四参数拟合曲线上的点的分布明显优于667 nmol／L，见图4。因此，确定最佳抗体浓度为100 nmol ／ L。

图4 抗体浓度的优化Fig.4 Optimization of antibody concentration

2.3 方法的验证

2.3.1 准确性 150%、130%、100%、70%、50%5 个相对活性浓度的SARS-CoV-2 抗体参考品的实际平均抑制率分别为162%、119%、95%、68%、48%，平均回收率分别为108%、92%、95%、97%、97%。回收率在80%～120%范围内，表明该方法具有良好的准确性。

2.3.2 线性范围 线性回归曲线见图5。SARSCoV-2 抗体参考品在50% ～150%相对活性浓度范围内，实际检测值与理论值呈良好线性关系，线性方程为：Y = 1.061 X - 7.72，R = 0.947 2。

图5 抑制率理论值与实际数值线性回归曲线Fig.5 Linear regression curve of theoretical value and measured value of inhibition rate

2.3.3 精密性

2.3.3.1 重复性 150%、100%和50% 3 个浓度的SARS-CoV-2 抗体参考品3 次检测抑制率的CV 分别为6%、5%、9%，均 < 10%，表明该方法具有良好的重复性。

2.3.3.2 中间精密性 2 名实验员检测50%、100%和150% 3 个浓度的SARS-CoV-2 抗体参考品相对活性CV 分别为12%、6%、7%，均< 15%。表明该方法具有良好的中间精密性。

2.3.4 专属性 SARS-CoV-2 抗体参考品的相对活性浓度与抑制率可拟合成四参数拟合曲线，重组抗RANKL 人源化全单克隆抗体及制剂缓冲液剂均未显示曲线，见图6。表明该方法具有良好的专属性。

图6 专属性验证结果Fig.6 Verification for specificity

2.4 建立方法在SARS-CoV-2 变异株中的应用针对假病毒拉姆达和德尔塔变异株的假病毒中和活性检测结果均可获得拟合曲线。假病毒拉姆达变异株的曲线较完整，有较好的拟合曲线，假病毒德尔塔变异株的拟合曲线上下平台的点数较少，需进一步优化。见图7。

图7 变异株拉姆达（A）和德尔塔（B）的假病毒中和活性图Fig.7 Neutralizing activities against Lambda（A）and Delta（B）variants of SARS-CoV-2 pseudovirus

3 讨 论

活性测定是对药物的有效成分和含量及药物效价的测定，是确保抗体类药物有效性的重要质控指标。本研究选用的假病毒表面表达病毒Spike 蛋白，并携带有荧光素酶基因，实现了假病毒的多功能性，且无遗传物质，只能感染1 次细胞，安全性高，能够模拟病毒入侵细胞的过程，因此选用Wuhan-Hu-1株假病毒建立SARS-CoV-2 假病毒中和活性检测方法。

ACE2 受体表达量的多少对假病毒中和活性检测具有重要影响，ACE2 受体量越多，体外活性试验越稳定、可操作性越强。本研究结果表明，HEK293T-hACE2 细胞的ACE2 受体在基因和蛋白水平远高于不同厂家来源的Huh-7 细胞。前期有研究将Huh-7细胞作为多种病毒药物筛选的体外模型系统，由于其膜蛋白上存在ACE2，可较好地反映人体环境，模拟体外活性试验，如用Huh-7 细胞系筛选莲花清瘟发挥的抗病毒和抗炎活性，需基于SARS-CoV-2 在Huh-7中的高度复制等［15-16］。近期有研究采用基因改造表达人源ACE2 的HEK293 细胞系筛选新型冠状病毒药物，如对特异性抗体抗病毒活性的检测［17］及对D614G 突变型新型冠状病毒结构和功能分析［18］等。由于基因改造表达人源ACE2 的HEK293 可在细胞膜上表达更多的ACE2 受体，体外模拟病毒入侵细胞时，使更多的携带荧光素酶基因的假病毒进入细胞，得到更佳的信号值，这可能也是众多研究者后期选择基因改造细胞的原因之一。

本研究通过对病毒滴度、细胞浓度及抗体浓度的优化，成功建立了SARS-CoV-2 假病毒中和活性检测方法，该方法具有良好的准确性、精密性、线性及专属性，可用于新冠抗体类药物早期筛选及研发过程中质量的控制。

另外，本研究采用假病毒德尔塔和拉姆达两种突变株进行假病毒中和活性检测，均获得了拟合曲线，其中假病毒拉姆达变异株的曲线较完整，拟合曲线较好，表明ACE2 表达量高的HEK293T-hACE2 细胞可作为假病毒中和活性的检测细胞，有望成为针对不断变异的SARS-CoV-2 建立更好的体外假病毒（甚至野毒）筛选的细胞模型。