磁珠法结合实时定量PCR 检测新型冠状病毒灭活疫苗中宿主细胞残留DNA 的验证及应用

周艳萍 ，卢佳 ，李茜 ，林凤杰 ，杨安纳 ，孟胜利 ，王泽鋆 ，申硕

1.武汉生物制品研究所有限责任公司，湖北 武汉 430207；2.国家联合疫苗工程技术研究中心，湖北 武汉 430207

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）引发的新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19，简称新冠）给公众健康造成了严重威胁。目前，在无特效药物用于治疗新冠的情况下，尽快研发和生产安全有效的疫苗是防控疫情蔓延的重要措施。基于此，不同种类的新冠疫苗正在研发，包括灭活疫苗、载体疫苗、核酸疫苗、重组亚单位疫苗等。截至2021年7月19日，有184 个新冠疫苗进入临床前研究，其中有108 个进入临床试验，其中有36 个进入Ⅲ期临床试验，基于Vero 细胞基质进行研究的灭活疫苗有10 个。武汉生物制品研究所有限责任公司研制的新冠灭活疫苗采用Vero 细胞基质，使用β 丙内酯2 次灭活，后期工艺采用两步柱层析，无核酸酶处理。以病毒的彻底灭活、无添加剂、高纯度病毒颗粒和病毒蛋白为工艺路线研究原则，确保安全性和保护效力。在临床前和临床Ⅰ／ Ⅱ期研究中安全性和免疫原性良好，目前已进入临床Ⅲ期研究［1］。

对于许多基于细胞基质的病毒性疫苗［2］来说，宿主细胞残留 DNA（residual cell DNA，rcDNA）是一种潜在的风险，主要是具有感染性和致瘤性［2-4］。为了保证生物制品的安全性，在生产过程中必须保证rcDNA 得到有效去除。WHO、《欧洲药典》、美国食品药品监督管理局（FDA）、《中国药典》三部（2020版）均对rcDNA 含量及片段大小做出了规定［4-12］。目前检测rcDNA 含量的方法有斑点杂交法、阈值法、荧光染色法及qPCR 法［13］。荧光染色法的优势在于其易用性和低成本，对于含DNA 水平较高的样品（如上游生物过程样本）具有一定的实用性，但其灵敏度较低，最低检测限仅为0.2 ng；阈值法检测rcDNA的灵敏度达1 ～3 pg，但其成本相对较高，通量低，DNA 片段小于600 bp 无法检出；杂交法的优点为成本低，在印迹前将DNA 与不同大小的DNA 标准品电泳可评估DNA 片段大小，缺点是耗时长，灵敏度较低［13-15］。与其他方法相比，qPCR 法具有简单、快速、更加灵敏、能检测含量较低的残留DNA 等优点［14-20］。为了评估新冠灭活疫苗（Vero 细胞）rcDNA含量，本实验采用磁珠法提取宿主细胞DNA，结合qPCR 法建立适用于新冠灭活疫苗（Vero 细胞）rcDNA的检测方法，并对方法进行验证及初步应用。

1 材料与方法

1.1 供试品 新冠灭活疫苗（Vero 细胞）原液及过程样品由武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究一室提供，包括制造批号XG202004Z007的工艺过程样品及该批次原液样品202005Y009，以及其他批次的疫苗原液样品202006Y014、202006-Y015、202006Y018、202009Y022、202009Y002BR。

1.2 主要试剂及仪器 宿主细胞残留DNA 前处理试剂盒、Vero 残留DNA-154 检测试剂盒及Vero 残留DNA 片段分析检测试剂盒均购自湖州申科生物技术有限公司；无水乙醇和异丙醇购自国药集团化学试剂有限公司；ABI 7500 定量PCR 仪购自美国Thermo 公司；rDNApurifyHCD 前处理系统购自湖州申科生物技术有限公司。

1.3 样品处理

1.3.1 标准品稀释 将Vero-154 检测试剂盒中Vero 细胞 DNA 标准品（30 ng ／ μL）用 DNA 稀释液稀释至 300、30、3、0.3、0.03、0.003、0.000 3 pg ／ μL。另取100 μL DNA 稀释液作为阴性对照。

1.3.2 供试品rcDNA 提取 按试剂盒说明书，用rDNApurify HCD 前处理系统提取rcDNA。

1.4 qPCR 检测 反应体系为qPCR Reaction Buffer 17 μL，VeroPrimer&Probe MIX-154 3 μL，模板 10 μL，混匀后 500 × g 离心 5 s，放入 7500 定量 PCR 仪中。反应条件为：90 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 个循环。

1.5 数据分析 qPCR 运行结束后，在结果分析窗口自动设置阈值，在此条件下用标准品的循环阈值（cycle threshold，Ct）对 DNA 浓度绘制标准曲线，将待测样品的Ct 值代入方程，计算其初始浓度。系统适用性及可接受标准：标准曲线决定系数（R2）≥0.99；PCR 扩增效率 90% ～ 110%，质控样品回收率：50% ~ 150%，相对标准偏差（RSD）≤30%。

Vero 细胞 DNA 残留量（pg ／ μL）= 样品测定平均值 ／10 μL × 稀释倍数 × DNA 洗脱体积 ／ 样品体积

1.6 磁珠法结合qPCR 的验证

1.6.1 线性和范围 取6 个浓度的Vero 细胞DNA标准品（30、3、0.3、0.03、0.003、0.000 3 pg ／ μL）各10 μL 进行 qPCR，重复 3 次。

1.6.2 专属性 考虑到在研制试剂盒的过程中已对其他种类的细胞做过专属性验证，在此仅对含Vero 细胞DNA 及不含Vero 细胞DNA 的样品进行专属性验证。取新冠灭活疫苗（Vero 细胞）原液和DNA 样品稀释液各 100 μL，分别加入 30 pg Vero 细胞 DNA 标准品，提取 DNA 进行 qPCR，重复 3 次，计算其回收率。同时取新冠灭活疫苗（Vero 细胞）原液和DNA 样品稀释液各 100 μL，提取DNA 进行qPCR，重复 3 次。

样品回收率（%）=（加标样品检测平均值 - 样品检测平均值）／ 加入的 Vero DNA 的量 × 100%

1.6.3 准确度 取DNA 稀释液100 μL，分别加入30、3、0.3 pg Vero 细胞 DNA 标准品，提取 DNA 进行qPCR，重复3 次，并计算回收率。

1.6.4 精密度

1.6.4.1 重复性 取新冠灭活疫苗（Vero 细胞）原液2 批（202009Y022、202009Y002BR），加入 30 pg 标准品，抽提DNA 进行qPCR，重复3 次，计算其RSD。同时取新冠灭活疫苗（Vero 细胞）原液100 μL，提取DNA 进行 qPCR，重复 3 次。

1.6.4.2 中间精密度 由2 名试验人员分别在不同时间取新冠灭活疫苗（Vero 细胞）原液2 批（2020-09Y022、202009Y002BR）100 μL，加入 30 pg 标准品，抽提DNA 进行qPCR，重复3 次，计算RSD。同时取新冠灭活疫苗（Vero 细胞）原液 100 μL，抽提 DNA进行qPCR。

1.7 方法的应用 使用该方法对新冠灭活疫苗（Vero细胞）生产过程样品（病毒收获液、浓缩液、纯化过程样品、原液）进行rcDNA 检测。随机选取3 批原液样本，磁珠法提取DNA 检测rcDNA，取回收率合格的样品再次进行片段大小检测，按照试剂盒说明书，进行qPCR 检测。

2 结 果

2.1 方法的验证

2.1.1 线性和范围 磁珠法结合qPCR 检测Vero细胞DNA 残留量的标准曲线线性结果见表1 和图1。3 次试验的标准曲线R2均大于0.99，PCR 扩增效率分别为91.71%、94.34%和96.78%，均满足要求，线性验证结果符合接受标准。DNA 检测范围为 0.000 3 ~ 30 pg ／ μL。

图1 线性和范围验证的扩增曲线及标准曲线Fig.1 Amplification and standard curves for linearity and range validation

表1 线性验证结果Tab.1 Validation for linearity

2.1.2 专属性 磁珠法qPCR 检测新冠灭活疫苗（Vero 细胞）原液中Vero 细胞DNA 残留量分别为0.51、0.47 和 0.45 pg ／ 10 μL，平均值为 0.48 pg ／10 μL。在疫苗原液中加入30 pg 的Vero 细胞DNA标准品后，回收率分别为61.98%、84.37%和74.00%。在 DNA 稀释液中加入 30 pg 的 Vero 细胞 DNA 标准品后，回收率分别为67.21%、63.96%和76.49%。回收率均在50% ～150%范围内，符合接受标准。见表2。

表2 专属性验证结果Tab.2 Validation for specificity

2.1.3 准确度 在100 μL DNA 稀释液中加入30、3和0.3 pg Vero 细胞DNA 标准品后，平均回收率分别为69.22%、70.70%和107.99%，均在50% ~ 150%范围内，符合接受标准。见表3。

表3 准确度验证结果Tab.3 Validation for accuracy

2.1.4 精密度

2.1.4.1 重复性 2 批新冠灭活疫苗（Vero 细胞）原液（202009Y022、202009Y002BR）的 rcDNA 含量分别为 0.35 和 0.05 pg ／ 10 μL；加入 30 pg 标准品后，重复检测3 次的RSD 分别为5.93%和6.65%，满足RSD ≤30%的要求，符合接受标准。见表4。

表4 重复性验证结果Tab.4 Validation for reproducibility

2.1.4.2 中间精密度 2 批新冠灭活疫苗（Vero 细胞）原液（202009Y022、202009Y002BR）Vero 细胞 DNA含量测定平均值分别为 0.54 和 0.06 pg ／ 10 μL；加入30 pg Vero 细胞标准品后，2 名测试人员在不同时间分别重复3 次，结果均符合接受标准。见表5。

表5 中间精密度验证结果Tab.5 Validation for intermediate precision

2.2 方法的应用 使用该方法对新冠灭活疫苗（Vero 细胞）生产过程样品进行rcDNA 检测，标准曲线R2≥ 0.99，扩增效率为90% ～110%，扩增曲线光滑平稳，峰值较高，且指数增长期、线性增长期及平台期明显，见图2，符合定量检测要求。纯化前样品Vero 细胞DNA 残留量最高，经一系列纯化后，Vero 细胞 DNA 残留量逐渐降低，低于 100 pg ／ 剂，见表6。3 批原液rcDNA 片段大小分布见表7，片段大于221 bp 的rcDNA 均未检测到。

表6 疫苗生产过程中Vero 细胞DNA 残留量的变化（pg／μL）Tab.6 Change of residual DNA content in Vero cells during vaccine production（pg ／ μL）

表7 3 批原液中DNA 片段大小分布情况（%）Tab.7 Size distribution of DNA fragments in three batches of bulk（%）

图2 疫苗生产过程样品rcDNA 检测的扩增曲线（A）及标准曲线（B）Fig.2 Amplification（A）and standard（B）curves for determination of rcDNA in samples during vaccine production

3 讨 论

以传代细胞系作为细胞基质的生物制品，其rcDNA 具有潜在的安全风险［6，13，21］。为了确保产品的安全性，厂家在产品开发过程中及药物监管均需确认生产工艺中 rcDNA 的去除程度［6，13-14，16-17］。目前，由于Vero 细胞易培养、生长快、能进行规模化的病毒培养，人用灭活疫苗大多采用Vero 细胞作为细胞基质进行研发及生产。几十年来，rcDNA 潜在的致癌性和感染性仍是关注的热点。研究发现，Vero细胞具有致瘤性，外源性DNA 的插入会导致原癌基因的激活及抑癌基因的失活［22-23］。通过DNA 酶降解或化学灭活（如β-丙内酯等）降低DNA 片段大小，rcDNA 的潜在风险可大大降低［23］。另一方面，若病毒或逆转录病毒的基因组存在于rcDNA 中，将存在潜在感染风险，当这种DNA 作为疫苗的成分接种时，可能会导致致病性感染［24］。因此，需严格控制rcDNA 含量。近年来，由于qPCR 检测rcDNA 更加快速、灵敏，qPCR 法逐渐应用于rcDNA 含量的检测，同时，qPCR 也可用于 rcDNA 片段大小的检测［13-14］。另外，还有一些新方法用于rcDNA 含量检测［25-27］。现行《中国药典》将qPCR 法加入rcDNA 含量的检测，并规定 rcDNA 含量应不高于 100 pg ／ 剂［12］。对于某些疫苗来说，rcDNA 含量不高于 10 pg ／ 剂［17］。许多基于Vero 细胞基质的疫苗在原液阶段rcDNA 含量不高于 100 pg ／ 剂［13］。

本研究使用磁珠法结合qPCR 对新冠灭活疫苗（Vero 细胞）中rcDNA 含量进行了验证，结果显示，方法的线性、专属性、准确度、重复性、中间精密度等各项指标均可达到方法验证的要求，可用于新冠灭活疫苗（Vero 细胞）的rcDNA 含量测定。在原液阶段，rcDNA 已大幅降低，在原液阶段配置为临床研究剂量后，其 rcDNA 含量小于 100 pg ／ 剂，片段大小小于200 bp，不足以编码为一个功能蛋白。通过对20 批次新冠疫苗（Vero 细胞）样品进行检测，发现其 rcDNA 含量均小于 100 pg ／ 剂（结果未呈现）。下一步将扩大验证规模，并检测其他以Vero 细胞为基质的病毒类疫苗的rcDNA 水平，为其他以Vero细胞为细胞基质的疫苗提供合理及客观的质量标准数据。

本研究中的新冠灭活疫苗（Vero 细胞）在临床Ⅰ／ Ⅱ期研究中安全性和免疫原性良好［1］。临床Ⅲ期研究正在开展。疫苗质量控制方法的建立、验证和应用，包括rcDNA 含量检测方法的完善，对疫苗获批上市后大规模生产、接种的持续质量控制具有重要意义。