芍药苷对1-甲基-4-苯基-吡啶离子诱导PC12细胞损伤保护作用的机制

陈明惠，郑梅竹，周密，王文丽，梁美帧，刘丽丽，严苗艺

1.长春师范大学生命科学院，吉林 长春 130032；2.长春师范大学中心实验室，吉林 长春 130032

帕金森病（Parkinson disease，PD）是一种以黑质致密部多巴胺神经元选择性和进行性退化，纹状体中多巴胺水平降低为主要特征的一种神经退行性疾病，严重影响人类健康［1-2］。目前，PD 确切的发病机制尚未明确，但氧化应激、线粒体功能障碍、细胞凋亡被认为是急性和慢性神经退行性疾病中神经元死亡的主要原因［3-5］。因此，抑制多巴胺能神经细胞死亡或通过调节细胞凋亡级联反应控制细胞凋亡成为预防和治疗PD 的新策略。目前治疗PD 的药物多为合成药物，毒副作用较大，在治疗上有一定的局限性，因此开发新型、高效、低毒、副作用小的天然抗PD 药物具有重要意义。

芍药苷（peoniflorin，PF）是从中国传统草药白芍中分离出的单萜糖苷，具有广泛的药理作用，目前主要用于治疗大脑局部供血不足［6］、羊癫疯（癫痫）［7］及中枢神经系统衰弱性疾病（如阿尔茨海默病［8］和 PD［9］）等。有研究表明，PF 对学习和记忆、镇痛和抗氧化方面均有显著作用［10-12］。有报道表明，PF可能通过激活腺苷A1 受体，改善神经递质功能，调节离子通道稳态，延缓氧化应激和神经细胞凋亡、促进神经生长而发挥保护作用［13-15］，但目前PF 抗PD活性的作用机制尚未明确。1-甲基-4-苯基-吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+）是一种神经毒素，有研究表明，MPP+诱导细胞死亡是在体外研究多巴胺能变性疾病的主要模型［16］。PC12 细胞是一种大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株，具有许多人类神经元的显著特征，是目前研究神经疾病的主要细胞模型。本研究采用MPP+诱导PC12 细胞损伤模型，模拟PD 患者脑神经元损伤状态，探讨PF 对MPP+诱导PC12 细胞损伤的保护作用在细胞水平的作用机理，为将PF 作为治疗PD 新药的深入研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞 PC12 细胞购自中国科学院细胞库。

1.2 主要试剂 PF 购自上海源叶生物科技有限公司；MPP+购自美国Sigma 公司；DMEM 培养基及胎牛血清购自吉林一向生物科技有限公司；美多芭购自上海罗氏制药有限公司；MTT 购自北京索莱宝科技有限公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测试剂盒、Fura-3 ／ AM 试剂盒及 Caspase-3 检测试剂盒均购自南京建成生物公司；线粒体膜电位检测荧光染料JC-1 及细胞蛋白裂解抽提试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗 Bax、Bcl-2、GAPDH 单克隆抗体均购自美国Abcam 公司；HRP 标记的羊抗兔IgG 购自美国 Thermo Fisher 公司。

1.3 细胞培养 将PC12 细胞用含10%胎牛血清、1%青-链霉素的高糖 DMEM，于 37 ℃，5% CO2培养箱内培养，细胞生长至贴壁约80%时，用0.25%胰酶消化，按1 ∶2 的比例传代。

1.4 PF 对PC12 细胞损伤作用的检测 取第4 代PC12 细胞，按 5 × 103～ 8 × 103个 ／ 孔加入 96 孔板，于 37 ℃，5%CO2培养箱内培养 24 h；分别加入 0、25、50、100、200 μmol／L PF，100 μL ／孔，继续培养 48 h；加入 MTT，100 μL ／ 孔，继续培养 4 h；弃上清，加入DMSO，100 μL ／ 孔，用酶标仪检测 A490。

1.5 细胞分组及给药 按1.4 项方法将PC12 细胞接种至96 孔板，培养24 h。分为正常对照组（常规培养，不给药）、MPP+损伤组（加入MPP+至终浓度为500 μmol ／ L）、阳性对照组（加入 MPP+至终浓度为500 μmol ／ L 和美多芭至终浓度为 50 μg ／ mL）、药物保护组（加入 MPP+至终浓度为 500 μmol ／ L 和 25、50 和 100 μmol ／ L 浓度的 PF）。均于 37 ℃，5% CO2培养箱内培养48 h 进行后续检测。

1.6 各组细胞计数及形态学观察 各组细胞于倒置相差显微镜下，观察并照相。

1.7 各组细胞活性的检测 于各组细胞中加入0.5 mg ／ mL 的 MTT，100 μL ／ 孔，于 37 ℃，5% CO2培养箱中培养 4 h；弃上清，加入 DMSO，100 μL ／ 孔，用酶标仪检测A490。

1.8 各组细胞LDH 释放量的测定 采用LDH 检测试剂盒检测各组细胞中的LDH 释放量，按说明书操作，用酶标仪检测A490，并按下式计算LDH 释放率。

LDH 释放率（%）= LDH 释放量 ／（LDH 释放量 + 未释放的LDH 含量）× 100%

1.9 各组细胞内Ca2+浓度的检测 采用Fura-3 ／ AM试剂盒检测各组细胞中的Ca2+浓度，按说明书操作后，于37 ℃培养45 min，荧光分光光度计上进行检测，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。

1.10 各组细胞周期的检测 取各组细胞，200×g 离心 5 min，收集细胞，PBS 缓冲液洗涤 3 ~ 4 次，用预冷的70%乙醇重悬细胞，加入200 μL 碘化丙啶（PI）和 RNase 混合物（终浓度分别为 50 和 100 μg ／ mL），于4 ℃遮光培养30 min；用流式细胞仪检测细胞周期，Cytometer 软件分析结果。

1.11 各组细胞中Caspase-3 活性的检测 用Caspase-3检测试剂盒中的裂解液充分裂解细胞，取上清液，与含缓冲液的Caspase-3 反应底物Ac-LEHD-pNA 和Ac-DEVD-pNA 混匀，用荧光分光光度计检测pNA 的最佳释放量，波长为405 nm。

1.12 各组细胞线粒体膜电位水平的检测 各组细胞加入 5 μg ／mL 的 JC-1，37 ℃避光孵育 20 min；PBS洗涤2 次。采用多功能细胞读板器进行检测，JC-1聚集体的激发波长为525 nm，发射波长为590 nm；JC-1 单体的激发波长为488 nm，发射波长为515 nm，以聚集体与单体荧光强度相对比例衡量线粒体膜电位。

1.13 各组细胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表达水平的检测用细胞蛋白裂解抽提试剂盒提取细胞总蛋白，蛋白质定量法测定蛋白的浓度。取30 μg 蛋白，经10%SDS-PAGE 分离后，转移至PVDF 膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭 1 h；分别加入兔抗 Bcl-2、Bax（1 ∶1 000稀释）及 GAPDH 单克隆抗体（1 ∶10 000 稀释），于 4 ℃培养过夜；TBST 洗涤 5 ~ 6 次，每次 5 ~ 10 min，加入HRP 标记的羊抗兔 IgG（1 ∶1 000 稀释），室温培养45 min；TBST 洗涤 3 ~ 4 次，ECL 显色。

1.14 统计学分析 应用SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析，所有实验数据以均值 ± 标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析和t 检验，以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PF 对 PC12 细胞的损伤作用 0、25、50、100、200 μmol ／ L PF 组 PC12 细胞活性分别为（100 ±7.65）%、（98.8 ± 13.02）%、（97.9 ± 3.30）%、（96.9 ±3.70）%、（86.6 ± 3.74）%。与 0 μmol ／ L PF 组比较，25、50、100 μmol ／ L PF 组细胞活性差异均无统计学意义（t 分别为 0.284、0.498、0.735，P 均 ＞ 0.05），200 μmol ／ L PF 组细胞活性明显降低（t = 3.178，P <0.01）。表明 PF 在 100 μmol ／ L 及以下浓度时对细胞无毒性。

2.2 各组细胞计数及形态学观察 镜下观察可见，正常对照组PC12 细胞呈圆形，细胞边缘完整而清晰；MPP+损伤组PC12 细胞数量减少，细胞体积明显缩小，核凝结；阳性对照组及药物保护组细胞损伤减弱，活细胞数量增多，部分细胞的细胞核恢复正常大小，部分细胞恢复完整，且随着PF 浓度的升高，活细胞数量增多。见图1。

图1 各组PC12 细胞形态的镜下观察（× 400）Fig.1 Microscopy of morphology of PC12 cells in various groups（× 400）

2.3 各组细胞的活性 正常对照组、MPP+损伤组、阳性对照组、药物保护组（25、50 和 100 μmol ／ L）PC12 细胞活性分别为（100 ± 0.243）%、（11.2 ±0.094）%、（66.2 ± 0.221）%、（43 ± 0.129）%、（65.4 ±0.129）%、（78.1 ± 0.122）%。MPP+损伤组 A490明显低于正常对照组（t = 1 009.56，P < 0.01），表明细胞受到明显损伤或部分细胞已死亡，细胞活性明显降低。与MPP+损伤组比较，阳性对照组及药物保护组（25、50 和 100 μmol ／ L）细胞活性明显升高（t 分别为 654.75、378.57、645.23、796.42，P 均 < 0.01），表明PF 和美多芭可减少细胞损伤，提高活细胞数量。

2.4 各组细胞的LDH 释放量 正常对照组、MPP+损伤组、阳性对照组、药物保护组（25、50 和 100 μmol／L）PC12 细胞的 LDH 释放率分别为（8.17 ± 0.52）%、（56.25 ± 3.14）%、（23.63 ± 2.23）%、（44.64 ±2.05）%、（33.41 ± 2.43）%、（27.6 ± 1.44）%。与正常对照组比较，MPP+损伤组LDH 释放率明显升高（t = 37.00，P < 0.01）；与 MPP+损伤组比较，阳性对照组及药物保护组（25、50 和 100 μmol ／ L）LDH 释放率明显下降（t 分别为 20.75、7.58、14.09、20.32，P 均<0.01）。表明PF 和美多芭可降低细胞内LDH的释放。

2.5 各组细胞内的Ca2+浓度 正常对照组、MPP+损伤组、阳性对照组、药物保护组（25、50 和 100 μmol ／ L）PC12 细胞中 Ca2+浓度分别为（308.7 ± 10.6）、（685.5 ±28.6）、（534.6 ± 20.2）、（471.8 ± 22.8）、（463.8 ±23.2）、（446.3 ± 40.5）nmol ／ L。与正常对照组比较，MPP+损伤组 Ca2+浓度明显升高（t = 24.23，P ＜0.01），表明细胞内Ca2+超载。与MPP+损伤组比较，阳性对照组及药物保护组（25、50 和 100 μmol ／ L）细胞 Ca2+浓度明显降低（t 分别为 9.33、13.21、13.71、14.79，P 均 ＜0.01）。表明美多芭或 PF 的细胞保护作用可能与降低细胞内Ca2+的超载有关。

2.6 各组细胞周期的变化 与正常对照组比较，MPP+损伤组 S 期细胞比例明显下降（t = 11.68，P ＜0.01），G0 ／ G1 期细胞比例明显升高（t = 7.81，P ＜0.01）；与MPP+损伤组比较，阳性对照组和药物保护组（25、50 和 100 μmol ／ L）G0 ／ G1 期细胞比例下降（t 分别为 2.14、0.56、1.33、4.14，P 均 ＜ 0.01），S 期细胞比例明显升高（t 分别为 3.90、2.16、4.27、8.90，P 均 ＜ 0.01），见图 2 和表 1。表明 PF 和美多芭可促进MPP+损伤细胞从G0 ／ G1 期向S 期转换。

表1 各细胞周期的细胞比例（%，，n ＝ 3)Tab.1 Percentages of cells at various stages of cell cycles in various groups（%，，n ＝ 3）

表1 各细胞周期的细胞比例（%，，n ＝ 3)Tab.1 Percentages of cells at various stages of cell cycles in various groups（%，，n ＝ 3）

注：与正常对照组比较，aa 表示P < 0.01；与MPP +损伤组比较，b 表示 P < 0.05，bb 表示 P < 0.01。

组别 G0 ／ G1 期 G2 ／ M 期 S 期正常对照组 48.3 ± 6.67 7.49 ± 1.12 44.23 ± 4.23 MPP+损伤组 79.7 ± 7.24aa 6.71 ± 0.63 13.60 ± 0.7aa阳性对照组 70.2 ± 8.79b 6.87 ± 7.9 23.00 ± 6.3药物保护组（μmol ／ L）100 61.3 ± 7.03bb 3.35 ± 0.07bb 35.30 ± 6.7bb 50 73.8 ± 6.77bb 2.27 ± 0.14bb 23.90 ± 1.41bb 25 77.2 ± 8.38bb 4.04 ± 0.6bb 18.80 ± 0.4bb

图2 各组细胞周期检测的流式细胞图Fig.2 Flow cytometry of cell cycles in various groups

2.7 各组细胞中Caspase-3 的活性 正常对照组、MPP+损伤组、阳性对照组、药物保护组（25、50 和100 μmol ／ L）PC12 细胞中 Caspase-3 的活性分别为（100 ± 0.04）%、（245 ± 15.6）%、（160 ± 12.5）%、（213 ± 13.8）%、（176 ± 12.1）%、（134 ± 11.4）%。与正常对照组比较，MPP+损伤组细胞中Caspase-3的活性明显升高（t = 20.69，P ＜ 0.01）；与 MPP+损伤组比较，阳性对照组及药物保护组（25、50 和100 μmol ／ L）细胞中 Caspase-3 的活性显著降低（t 分别为 11.18、4.21、9.08、14.61，P 均 ＜ 0.01）。表明 PF能抑制MPP+诱导PC12 细胞损伤引起的Caspase-3活性升高。

2.8 各组细胞线粒体的膜电位水平 正常对照组、MPP+损伤组、阳性对照组、药物保护组（25、50 和100 μmol ／ L）PC12 细胞线粒体的膜电位水平分别为（100 ± 4.6）%、（38.14 ± 2.74）%、（78.26 ± 3.57）%、（53.16 ± 3.41）%、（79.31 ± 3.84）%、（88.96 ± 3.57）%。与正常对照组比较，MPP+损伤组细胞线粒体的膜电位水平明显下降（t = 29.10，P ＜ 0.05）；与 MPP+损伤组比较，阳性对照组及药物保护组（50 和100 μmol ／ L）细胞线粒体的膜电位水平明显升高（t 分别为 20.17、20.69、25.54，P 均 ＜ 0.05），25 μmol／L药物保护组的膜电位水平升高，但差异无统计学意义（t = 7.55，P ＞ 0.05）。表明 MPP+诱导 PC12 细胞受损的效率提高，从而导致线粒体膜电位降低；而PF 能够增强线粒体膜电位，缓解MPP+对PC12 细胞的损伤。

2.9 各组细胞中Bcl-2 和Bax 蛋白的表达水平 正常对照组、MPP+损伤组、阳性对照组、药物保护组（25、50 和 100 μmol ／ L）PC12 细胞中 Bcl-2 蛋白的表达水平分别为 0.91 ± 0.075、0.39 ± 0.02、0.66 ± 0.03、0.67 ± 0.04、0.65 ± 0.03、0.68 ±0.03，Bax 蛋白的表达水平分别为 0.51 ± 0.01、0.85 ± 0.067、0.46 ± 0.02、0.43 ± 0.03、0.41 ±0.03、0.36 ± 0.02，Bcl-2 ／ Bax 分别为 6.75 ± 0.06、0.45 ± 0.01、1.55 ± 0.02、1.67 ± 0.01、1.72 ± 0.04、2.02±0.01。与正常对照组比较，Bcl-2／Bax 比值显著降低（t=29.93，P < 0.01）；与 MPP+损伤组比较，阳性对照组及药物保护组（25、50 和 100 μmol ／ L）细胞Bcl-2 ／Bax 比值明显升高（t 分别为 63.45、100.2、46.93、138.86，P 均<0.01）。见图3。表明PF 能够增加MPP+损伤细胞后Bcl-2 ／ Bax 比值，从而发挥抗凋亡作用。

图3 Western blot 法检测各组细胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表达水平Fig.3 Determination of Bcl-2 and Bax expression levels in various groups by Western blot

3 讨 论

本研究采用MPP+诱导PC12 细胞损伤模型，探讨PF 对该损伤的保护机制。通过形态学观察可见，与正常对照组比较，MPP+损伤组PC12 细胞数目减少，细胞形状呈近似圆形，出现明显的细胞体减小和核凝结，细胞连接减少；阳性对照组及药物保护组细胞恢复正常核大小和完整，表明PF 对MPP+诱导的PC12 受损细胞具有显著的保护功能。

有研究表明，在神经毒素中暴露神经元细胞，由于细胞受损，膜通透性发生了变化，使LDH 释放量明显增多，也会造成胞内Ca2+超载，导致细胞受损［17-18］。同时线粒体在神经退行性变中起关键作用，线粒体作为氧化反应及产生活性氧（recutive oxygen species，ROS）的主要场所，MPP+能够导致细胞内ROS 增多，进而降低线粒体膜电位，导致线粒体细胞色素C 释放，进而激活Caspase-3，介导细胞凋亡发生［19］。细胞凋亡一个重要特征主要是线粒体膜电位的破坏，线粒体膜电位的破坏作为凋亡级联反应过程中最早发生的细胞内事件之一，诱导细胞凋亡的发生。在细胞凋亡中Caspase-3 是关键的主导者，有实验证实，Caspase-3 参与MPP+诱导细胞凋亡，Caspase-3 激活可介导线粒体途径相关凋亡的产生［20］。本研究结果表明，MPP+损伤细胞后，LDH 释放量、细胞内Ca2+浓度增多及线粒体膜电位降低，PF可通过逆转这些现象的发生而发挥神经保护作用。另外，Caspase-3 在PC12 细胞中的活性在培养48 h后明显升高，但 100 μmol ／ L PF 作用后 Caspase-3 活性降低43%，表明PF 可作为MPP+的拮抗剂。

有研究表明，细胞凋亡受Bcl-2 家族作用调节蛋白的影响，包括促凋亡蛋白Bax 和抗凋亡蛋白Bcl-2［21-22］。有文献显示，Bcl-2 可与线粒体膜及 Bax结合，从而形成Bcl-2 ／ Bax 异二聚体，引起线粒体通透性过渡孔关闭，阻止细胞色素C 的释放，从而抑制细胞凋亡［23-24］。同时，Bcl-2 还可结合Bak 形成Bak／Bcl-2 异二聚体，受凋亡刺激后，Bax、Bak 能够形成寡聚体，影响线粒体膜通透性，使细胞色素C 从线粒体进入细胞质，激活与Caspase 相关的细胞质凋亡级联反应。本研究结果表明，MPP+处理后细胞中Bcl-2表达量降低，Bax 表达水平升高，导致 Bcl-2 ／ Bax 比值显著降低（P < 0.01），经 PF 处理后 Bcl-2 ／ Bax 比值显著增加（P < 0.01），与阳性药物美多芭作用一致。表明PF 的神经保护作用与升高Bcl-2 ／ Bax 比值有关。

综上所述，PF 对MPP+诱导的PC12 损伤细胞有显著的保护作用，这种作用可能通过减少LDH 释放、降低胞内Ca2+超载、促进细胞增殖、降低Csapase-3活性、提高线粒体膜电位和Bcl-2 ／ Bax 比值实现。本研究为苷类化合物抗PD 作用机制的进一步研究及高效、低毒抗PD 药物的研发提供了实验依据。