小米中4种蛋白的分级提取及结构表征

侯超凡， 陈振家， 郝利平

(山西农业大学食品科学与工程学院，太谷 030801)

小米又称栗米，是我国北方广泛种植的作物之一，由谷子脱壳而成[1]。小米所含的各种营养素丰富，口感良好，深受北方人的喜爱[2]。小米中营养素比例比较均衡，是一种良好的饮食来源。相较于其他常见的谷物，小米的营养价值更优，与水稻、玉米等谷物相比，小米的蛋白质含量更高[3]；与大米和小麦等谷物相比，小米中所含的钙、膳食纤维也更多[4]。同时，小米蛋白也是优质蛋白的来源，其消化率高达83.4%，可用于食品调味品、营养强化剂、食品添加剂等多个领域中[5]。

小米中含有丰富的蛋白质，其蛋白具有低过敏性的特点[6]。小米蛋白质的氨基酸组成模式中赖氨酸和苏氨酸是限制性氨基酸，但其必需氨基酸的含量高于稻米和小麦[7]。小米蛋白质根据溶解特性分为4种蛋白，水溶性的清蛋白，盐溶性的球蛋白，醇溶性的醇溶蛋白以及碱溶性的谷蛋白[8]。大多数谷物蛋白有一个共同特点：谷物蛋白中清蛋白和球蛋白的含量极少，醇溶蛋白和谷蛋白含量较高。魏益民等[9]用Osborne分级提取法提取小米蛋白，结果发现醇溶蛋白和谷蛋白分别占46.0%和21.2%，清蛋白和球蛋白共占5.5%。与玉米醇溶蛋白相似，小米醇溶蛋白表面疏水性高，难溶于水，易溶于醇[10，11]。姬中伟[7]对小米醇溶蛋白进行改性酶解制备了具有抗氧化活性的小米醇溶蛋白肽，结果发现酶解小米醇溶蛋白肽在小鼠体内具有抗氧化和抗炎活性。目前小米蛋白的提取方法主要为碱提酸沉法[12]和Osborne分级提取法，杨桦等[13]发现超声波辅助酶法有助于提取蛋白。然而目前国内外对于小米蛋白完整的结构表征报道较少。

采用Osborne分级提取法提取小米4种蛋白，对4种蛋白的微观形态，亚基分子质量分布，粒径和Zeta-电位，二级结构，紫外光谱、荧光光谱以及表面疏水性进行结构方面的研究，为小米蛋白产品的应用和开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

晋谷21号小米购于山西晋中；PBS缓冲液；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒；考马斯亮蓝G250；5x非还原型蛋白上样缓冲液；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SHIA-10A-50A冷冻干燥机；Nicolet iS10傅里叶红外(FT-IR)光谱仪；JSM-7500F冷场发射扫描电子显微镜；YS-04A小型高速粉碎机；KDC-1044L大容量低速离心机；HC-2064高速离心机。

1.3 方法

1.3.1 样品的制备

将小米粉碎、过筛，用石油醚对小米粉进行脱脂，干燥后采用Osborne分级提取法[14]分级提取出清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。清蛋白使用蒸馏水(料液比1∶10)进行提取，球蛋白使用质量分数为2%的氯化钠溶液(料液比1∶10)进行提取，醇溶蛋白使用80%乙醇溶液(料液比1∶10)进行提取，谷蛋白使用0.05 mol/L的氢氧化钠溶液(料液比1∶10)进行提取，提取出的蛋白进行透析除盐。

1.3.2 扫描电镜观察

使用冷场扫描电子显微镜[15]对小米4种蛋白进行微观形态观察，加速电压为5 kV，观察倍数为1 000～30 000，使用配套软件进行捕捉图像。

1.3.3 SDS-PAGE分析

参考Laemmli[16]的SDS-PAGE法对小米4种蛋白进行分析，将蛋白样品溶解于还原型上样缓冲液中，振荡完全后置于沸水中充分反应5 min，冷却后离心备用。电泳胶采用12%的分离胶和5%的浓缩胶制得，在电泳槽位依次加入5 μL的Maker蛋白标样以及20 μL的蛋白上样缓冲液。浓缩胶电压为100 V，分离胶电压为150 V，条带距底部1 cm处电泳停止。将电泳胶进行染色及脱色后扫描成图分析。

1.3.4 粒径分布、平均粒径及Zeta电位测定

通过电位分析仪对小米4种蛋白组分悬浮粒径进行测定，清蛋白、球蛋白及谷蛋白用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释至1 mg/mL进行测定，醇溶蛋白用70%乙醇溶液稀释至1 mg/mL进行测定，测定三次结果取平均值，采用相同方法进行Zeta-电位测定[17]。

1.3.5 傅里叶红外光谱测定

利用傅里叶红外光谱仪对小米4种蛋白的二级结构进行测定[18]，将冻干样品和溴化钾研磨均匀后压片置于光谱仪中进行分析，记录样品在400～4 000 cm-1透过率的变化。

1.3.6 紫外光谱测定

通过紫外分光光度计测量小米4种蛋白溶液的紫外光谱[19]，扫描波长范围为200～400 nm，扫描速度为300 nm/min，数据间隔为0.5 nm。清蛋白、清蛋白、谷蛋白使用PBS缓冲液(pH 7.4)稀释到1 mg/mL进行测定，醇溶蛋白用70%乙醇溶液稀释至1 mg/mL进行测定[20]，每个测定做三组平行结果取平均值。

1.3.7 荧光光谱测定

使用荧光光度计测量小米4种蛋白溶液的荧光光谱[21]，设定激发波长为280 nm，狭缝宽度为3 nm，扫描波长范围为290～430 nm。清蛋白、清蛋白、谷蛋白使用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释到1 mg/mL进行测定，醇溶蛋白用70%乙醇溶液稀释至1 mg/mL进行测定，每个测定做三组平行取平均值。

1.3.8 表面疏水性测定

通过ANS荧光探针法[22]测定小米4种蛋白的表面疏水性。使用0.02 mol/L的PBS缓冲液(pH 7.4)将4种蛋白分别稀释至0.01、0.05、0.1、0.2 mg/mL，将4 mL的蛋白稀释液与20 μL的ANS溶液(8 mmol/L)混合振荡后避光反应，15 min后放于荧光光度计中测定荧光强度。将蛋白质量浓度(mg/mL)与测得的荧光强度作图，经过线性回归拟合后求得斜率作为4种蛋白的表面疏水性。

1.4 数据处理

本研究均进行3次重复试验，并使用Origin 9.1、PeakFitv4.12、GraphPad Prism 8软件作图分析。

2 结果与分析

2.1 小米4种蛋白微观形态

使用扫描电镜对小米4种蛋白的微观形态进行了观察。图1a中清蛋白的直径在200 nm左右，清蛋白颗粒之间呈现不同程度的融合和折叠；图1b中球蛋白的直径在100～500 nm之间，蛋白之间形成了簇状结构，发生了一定程度的拉伸与融合，形状多样，有呈块状的趋势；图1c中醇溶蛋白的直径在50～500 nm之间，颗粒分明，聚集程度小，但堆积程度高；图1d中谷蛋白的直径在200～1 100 nm之间，蛋白大小不一，没有发生聚集，但都堆积在一起。Gulati等[23]在黍米粉和提取的蛋白质中观察到球形蛋白体，以簇状形态存在，与本实验结果相似。

图1 小米4种蛋白的微观形态

2.2 小米4种蛋白的亚基分布

小米4种蛋白的亚基分布如图2所示。清蛋白的分子质量分布在11～180 ku之间，亚基条带分布广，无特征亚基条带出现；球蛋白的分子质量分布在11～75 ku之间，亚基条带主要集中在11～19 ku，球蛋白有两条明显的特征亚基条带出现，分子质量分别为18 ku和66 ku；醇溶蛋白的分子质量分布在11～22 ku之间，条带分布清晰，有三条明显的特征亚基条带，其分子质量分别为12、18、22 ku，醇溶蛋白的这三条亚基带分别名为α-醇溶蛋白、β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白，这与郭莲东[24]等的研究相似；谷蛋白的分子质量分布在17～180 ku之间，谷蛋白有4条明显的特征亚基条带，其分子质量分别为18、22、95、180 ku。除了球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白具有特征亚基带外，小米4种蛋白含有一些分子质量相同的亚基带。

图2 小米4种蛋白的亚基分布

2.3 小米4种蛋白粒径分布、平均粒径和Zeta-电位分析

通过电位分析仪的动态光散射技术测定了4种蛋白悬浮液的粒径分布、平均粒径以及Zeta-电位。从图3可见，悬浮液中的清蛋白粒径分布在50～950 nm之间，粒径为295 nm的清蛋白聚集体强度最高；球蛋白粒径分布在150～600 nm之间，粒径为220 nm的球蛋白聚集体强度最高；醇溶蛋白粒径分布在0～300 nm之间，粒径为24.4 nm和142 nm处的醇溶蛋白聚集体强度较高；谷蛋白粒径分布在0～600 nm之间，粒径为164 nm处的谷蛋白聚集体强度最高，4种蛋白中球蛋白分布最紧凑，粒径强度也更高。

图3 小米4种蛋白的粒径分布

平均粒径可以反映蛋白颗粒群体的平均尺度。从图4可见，清蛋白聚集体的平均粒径为215 nm，球蛋白聚集体的平均粒径为225 nm，醇溶蛋白聚集体的平均粒径为162 nm，谷蛋白聚集体的平均粒径为144 nm，4种蛋白中球蛋白的平均粒径最大。平均粒径结果表明清蛋白和球蛋白的分子粒径较大，这可能与清蛋白和球蛋白的簇状结构有关，聚集程度高，这与扫描电镜中对其表观形貌的观察结果相一致。

图4 小米4种蛋白的平均粒径

由于蛋白纳米颗粒会带有电荷，电荷会影响周围悬浮液的离子分布，颗粒周围的滑动层为Zeta-电位，所以Zeta-电位的绝对值大小可以反应悬浮液的稳定性[25]。Zeta-电位的绝对值小于30 mV表示悬浮液不稳定，相反Zeta-电位的绝对值大于30 mV表示悬浮液体系稳定。由图5可见，清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的Zeta-电位分别为-11.63 mV、19.77 mV和-7.94 mV，这三种蛋白Zeta-电位的绝对值都小于30mV，说明三种蛋白悬浮液稳定性差，更容易产生沉淀，谷蛋白的Zeta-电位为-34.97 mV，其绝对值大于30 mV，这表明谷蛋白的悬浮液稳定性很好，保存时间更长。

图5 小米4种蛋白的Zeta-电位

2.4 小米4种蛋白红外结构分析

图6 小米4种蛋白的红外光谱

从表1中可以看到4种蛋白中都含有α-螺旋、β-折叠、β-转角、β-反平行折叠和无规则卷曲结构。其中α-螺旋、β-折叠以及β-转角结构含量较高，β-反平行折叠和无规则卷曲结构含量较低。特别地，与其他三种蛋白相比醇溶蛋白α-螺旋结构的含量明显较低。

2.5 紫外光谱分析

蛋白中由于含有一些发色基团(羰基、羧基等)，这些发色基团可以吸收部分波长的紫外光而使得蛋白具有紫外吸收光谱，发色基团不同，蛋白的吸收峰位置也不同[27]。从图7中可以清晰看到4种蛋白分别含有两个特征吸收峰，清蛋白和球蛋白在210 nm处有特征吸收峰，醇溶蛋白和谷蛋白在225 nm处有特征吸收峰；220 nm附近吸收峰的形成主要是由于蛋白中的肽键所引起的，还可以看到球蛋白在260 nm处有较强的特征吸收峰，此吸收峰的形成可能跟苯丙氨酸残基发光有关，这表明球蛋白内苯丙氨酸在微环境中表达程度较高，清蛋白和谷蛋白在275 nm处有微弱的特征吸收峰，醇溶蛋白在280 nm处有较强的特征吸收峰，280 nm附近吸收峰的形成是由于色氨酸残基和酪氨酸残基内的共轭双键引起的，说明这三种蛋白中酪氨酸、色氨酸的表达程度高。

表1 小米4种蛋白二级结构的含量

图7 小米4种蛋白的紫外光谱

2.6 荧光光谱分析

与紫外光谱相似，酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的氨基酸残基在紫外光的激发下会发射荧光，因此荧光光谱检测是对蛋白结构表征的常用手段[28]。当激发波长为280 nm时，蛋白质内表达荧光的氨基酸有色氨酸和赖氨酸，色氨酸的荧光强度更高，因此以检测色氨酸为主的荧光强度可以反映4种蛋白的三级结构。由图8可知，在固定激发波长为280 nm的条件下，清蛋白在349 nm处荧光强度最高，球蛋白在348 nm处荧光强度最高，醇溶蛋白在341 nm处荧光强度最高，谷蛋白在342 nm处荧光强度最高。根据荧光强度可以初步判断，4种蛋白中色氨酸与酪氨酸总量：清蛋白>醇溶蛋白>球蛋白>谷蛋白。

图8 小米4种蛋白的荧光光谱

2.7 小米4种蛋白的表面疏水性

蛋白质的表面疏水性与其在水中的溶解度有关，溶解度越高，表面疏水性越低[29]。疏水性氨基酸越多，越可以改善水和蛋白质的相互作用，从而达到稳定蛋白质的效用。此外蛋白质的起泡性、起泡稳定性、乳化性以及乳化稳定性都与表面疏水性有关。从图9可以看出，疏水性：醇溶蛋白>球蛋白>谷蛋白>清蛋白。参考Osbrone分级提取法的原理，清蛋白是由蒸馏水提取出来的，说明清蛋白更能溶于水，结果也显示清蛋白的疏水性最低，醇溶蛋白由醇类试剂提取，在水中的溶解度不强，所以醇溶蛋白的表面疏水性最高，盐提的球蛋白和碱提的谷蛋白疏水性介于中间。

图9 小米4种蛋白的表面疏水性

3 结论

通过SDS-PAGE、扫描电镜、粒径、Zeta-电位、FTIR、紫外光谱、荧光光谱、表面疏水性对小米4种蛋白进行结构表征。可以发现微观状态下的清蛋白和球蛋白存在簇状结构，有呈块状的趋势，粒径分析也表明清球蛋白平均粒径较大，醇溶蛋白和谷蛋白堆积程度高，但蛋白颗粒分明，不聚集。从电泳图中观察到醇溶蛋白亚基分子质量低(11～25 ku)，亚基带分布明显清晰，而小分子蛋白更容易被人体消化吸收，清蛋白、球蛋白、谷蛋白亚基带分布广泛。醇溶蛋白Zeta-电位最低，在介质中最不稳定，更容易产生沉淀，谷蛋白的Zeta-电位绝对值超过30 mV，说明其在介质中最稳定，保存时间更长。二级结构可发现4种蛋白中各个结构都有占比，在有序结构中，清蛋白的α-螺旋和β-折叠所占比例最高(55.18%)，其次是谷蛋白(54.80%)和球蛋白(52.93%)，而醇溶蛋白的有序结构占比最低(43.75%)。紫外光谱和荧光光谱显示4种蛋白在紫外光的照射下均出现不同波长特征吸收峰，这与其内含氨基酸残基有关。清蛋白表面疏水性最低，溶解性更好，醇溶蛋白与之相反，而溶解性又与蛋白质的功能性质如起泡性、起泡稳定性等有关，因而，醇溶蛋白的功能性质较差，不利于加工，利用率低，之后研究可利用一些方法对醇溶蛋白进行改性，从而改善其功能性质。