青海省野生中国沙棘根际解磷菌的初步研究

韩景浩

(青海大学农牧学院， 青海 西宁 810016)

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)为落叶灌木，其根有根瘤，是非豆科木本固氮树种，广泛分布于我国华北、西北、西南等地，其具有良好的环境保护特性，能在恶劣环境下生存，具有防风固沙以及能在缺水环境下正常生长发育。因此,被广泛用于水土保持，作为改良土壤的优良树种，目前已成为水土流失治理的先锋树种，在我国西北部大量种植，具有极高的生态研究价值[1-3]。

植物根际的存在使得周围环境在各种理化特性和生物学性质上与土壤主体不一致[4，5]。根际土壤的存在与陆地微生物生态系统的关系密切，决定了陆地微生物生态系统的多样性，根际有益微生物与植物根系相互作用，通过寄生、异生和互生的方式与土壤共同组成了一个极其特殊的生态系统。根际有益微生物具有很好的优势，它们自身具有种类多、生长周期短、繁衍至下一代时间短、生化反应相应的代谢酶活力强劲，对土壤中各种有益但难以被植物吸收利用的营养物质的分解转化具有相对较强的促进作用，既有利于植物保持活力，也有利于土壤环境的健康、维持土壤生态，对绿色农业的发展具有相当重大的意义[6-15]。PGPR对植物促生效果主要体现在解磷、解钾、固氮等层面[16]。研究表明解磷菌解磷能力的发挥主要是解磷促生菌能够通过自身发酵产生某些有机酸(如丙酸、乙酸和甲酸等)，酸性物质的存在使植物根周围土壤酸碱环境发生改变，使其pH值下降，使难以被植物吸收利用的难溶性或不溶性的无效磷能够转变为易于被植物吸收利用的可溶性的速效磷，达到促进生长发育的效果[17]。解磷菌的存在能明显改善根系对磷元素的吸收，为植物的生长发育提供更加充足的营养物质，改良植物的营养状况[18-22]。可以看出前人的研究主要是在其他植物上对解磷菌研究较多，而关于沙棘根际解磷菌解磷能力的研究较为滞后。

因此，本研究对于青海省西宁市湟中区野生中国沙棘根际解磷菌进行初步研究，旨在发现具有解磷效应的优势菌株，为进一步对整个西北地区解磷菌进行更深层次的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 土样与培养基

土样：选择青海省西宁市湟中区上台村野生中国沙棘分布区的林区，采集野生中国沙棘的根际土壤作为试验研究的初始材料。

培养基：有机磷细菌培养基(含琼脂或不含琼脂；青岛高科园海博生物技术有限公司)用于解有机磷细菌的分离及解磷能力测定；无机磷细菌培养基(含琼脂或不含琼脂；青岛高科园海博生物技术有限公司)用于解无机磷细菌的分离和溶磷能力的测定；普通肉汤培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司)用于细菌的增菌培养；牛肉膏蛋白胨培养基(上海索莱宝生物科技有限公司)用于细菌的纯化。

1.2 试验方法

样点选择：采样前，选择土质相对肥沃的林区，利用X形采样的方法，整个大区(涵盖此区域所有的范围)选择5个大采样点，每个大样点涵盖5-6个小样点，每个小样点采集的土壤约20-35g 左右。

采样操作：在取土之前事先用酒精对铁锹进行消毒处理，然后进行土样的采集，取表层20cm以下连同中国沙棘根系的阳面肥沃的土壤，装入事先编好号的无菌自封袋中，带回实验室后充分混在一起，轻轻抖动根系以保证土壤充分从根系落下，过筛去掉土壤中较大的颗粒土，然后将处理好的中国沙棘根际土壤于4℃冰箱冷藏保存，用于后续根际促生菌的研究。

解磷菌的分离：采用张晶晶[16]研究中的梯度稀释法得到不同梯度的土壤混悬液。采用其分离方法得到解磷菌单菌落，选择带有菌圈、个头较大的菌落利用牛肉膏蛋白胨培养基进行划线纯化培养(划线3代以上)。按着其方法获得的单菌落制备菌悬液，具体操作为取一环已纯化的待测菌株单菌落接种在7-10ml的肉汤培养液中，在37℃、170rpm下，于恒温振荡培养箱中震荡培养，待菌液混浊既可[16]。

解磷能力测定(初筛)：采用张晶晶[16]的方法，利用打孔器在解磷菌班上打孔，将菌悬液植入到孔中，培养1d和3d，通过比较菌圈半径，确定解磷能力大小，具体见相应的文献。

解磷能力检测(复筛)：(1)采用张晶晶[16]的方法进行摇管培养，具体步骤见相应的文献。(2)菌发酵液中磷含量的测定：培养结束后，取培养1d、3d和6d磷细菌发酵液3ml，于4℃、5000rpm下离心15min，吸取上清液，解无机磷菌吸2.5ml，解有机磷菌吸2.5ml，经滤膜过滤至检测杯中，采用吴丹丹等方法[23]，运用AA3全自动流动分析仪进行总磷的测定，每个样品测量3个重复，通过分析总磷含量，确定菌株解磷能力强弱。

1.3 数据处理

本试验数据处理采用的软件为Microsoft Excel 2010 。利用其对数据进行统计和分析。

2 结果与分析

2.1 解磷菌的分离

通过对采集到的中国沙棘根际土菌液的分离共得到72株待测解无机磷菌和24株待测解有机磷菌，分别进行编号，具体为WP1-WP72和YP1-YP24。

2.2 解磷菌的初筛结果与分析

对分离得到的72株待测解无机磷菌和24株待测解有机磷菌进行解磷圈法试验，这些待测菌的菌圈结果相对较小，解无机磷菌圈效果相对较好的有18株菌，解有机磷菌圈效果较好的有12株菌。结果见表1、表2和图1、图2。

图2 解磷菌的解有机磷能力测定Figure.2 Solution of organic phosphorus ability test of phosphate-solubilizing bacteria

表1 解无机磷菌菌圈半径Table.1 Inorganic phosphate solubilizing bacteria circle radius

表2 解有机磷菌菌圈半径Table.2 Radius of organophosphate solubilizing bacteria circle

图1 解磷菌的解有机磷能力测定Figure.1 Solution of organic phosphorus ability test of phosphate-solubilizing bacteria

从表1和图1可以看出，培养1d后，解磷菌在解无机磷平板上形成了透明圈，其半径为1.02-3.15mm；培养3d后，各菌株都形成了明显的透明圈，其半径为1.66-7.22mm。其中WP1、WP3、WP4、WP5和WP7-WP12这10株菌相对来说解磷初筛效果较好。

从表2和图2可以看出，培养1d后，解磷菌在解有机磷平板上均形成了菌圈，其半径为0.97-2.01mm；培养3d后，各菌株都形成了明显的浑浊圈，其半径为2.56-5.05mm。其中，解有机磷效果相对较好的菌株有：YP1、YP2、YP3、YP4、YP5、YP6和YP7。

2.3 解磷菌的复筛结果与分析

流动分析仪检测磷含量的标准曲线见图3。

图3 流动分析仪的磷标准曲线Figure.3 The phosphorus standard curve of flow analyzer

图3表明，流动分析仪标准曲线符合检测规定，检测数据可靠。将初筛得到的18株解无机磷菌株和12株解有机磷菌株与CK(加入等量灭活培养液)一起进行液体摇瓶复筛，解磷菌用流动分析仪进行检测，其发酵液在1d、3d、6d的可溶性磷含量测定结果见表3、表4和图4、图5。

表4 解有机磷菌株可溶性磷含量的测定Table.4 Determination of the soluble phosphorus content of organophosphate decomposing strains

由表3和图4可知，随着接种天数的增加，解无机磷菌株发酵液中可溶性磷含量在1-3d全部呈上升趋势，大部分在3-6 d呈下降趋势，只有WP-6、WP-8、WP-9和W17菌株的发酵液中可溶性磷含量呈上升趋势，这说明全部待测菌株，前3d的解无机磷能力相对较强，除了上述4株菌株外，其他菌株3-6d解无机磷能力变弱(根据可溶性磷含量检测的趋势)。但是与CK相比较，除了第1d WP-4菌株可溶性磷含量的值略微大于CK值，其它所有菌株所有天数的可溶性磷含量的检测值都小于CK值，表明这些待测菌株解磷效果相对较低。

表3 解无机磷菌株可溶性磷含量的测定Table.3 Determination of the soluble phosphorus content of inorganic phosphorus solubilizing strains

图4 解无机磷菌株可溶性磷含量的测定Figure 4.Determination of the soluble phosphorus content of inorganic phosphorus solubilizing strains

由表4和图5可知，随着接种天数的递增，解有机磷YP-1—YP-6菌株发酵液中可溶性磷含量在1-3d呈上升趋势，YP-7、YP-9、Y-10和YP-12呈下降趋势，而在3-6d中，所有菌株都呈下降趋势。此外，与CK相比，YP-4、YP-6、YP-7和YP-10在第1d的解磷能力均大于CK，其中Y-7和Y-10相对较好，Y-4和Y-6略微大于CK，但在第3d，所有菌株的可溶性磷含量都小于CK值，表明在第3d，所有待测菌株几乎没有解磷能力，而在第6d，除了菌株YP-5的可溶性磷含量略大于CK外(YP-5在第6d的可溶性磷含量为0.4098mg/L)，其他所有菌株可溶性磷含量都等于0。这表明除了第1d的YP-7和YP-10的解有机磷的能力相对较好，其他菌株其他天数的所有菌株的解有机磷能力相对较弱。

图5 有机磷菌株解磷能力测定Figure.5 Determination of Phosphate Solubilization Ability of Organophosphate Strains

3 讨论与结论

张晶晶等[24]在新疆核桃根际解磷菌的研究中分析解磷菌的解磷效果明显都高于CK值，有14株解磷效果较好的解磷菌；郭艺鹏等[25]在枣树根际解磷菌的研究发现了2株比较好的解无机磷菌以及2株比较好的解有机磷菌株；赵树栋等[26]在高原早熟禾根际促生菌的研究中发现了4株解无机磷菌株和3株解有机磷菌株。而本研究的结果与以上学者的研究结果相比较，所研究的青海省西宁市湟中区野生中国沙棘根际土壤细菌中根际解磷菌菌种解有机磷和解无机磷活性相对较低，解磷能力比较弱。

造成以上结论的原因是：(1)研究方法的局限性。通常利用有无解磷圈菌圈和大小作为判定解磷微生物是否具有解磷能力的指标，但是此方法不是对全部的解磷微生物解磷能力检测都有成效。由于微生物对难溶性磷存在特异性、非特异性及选择性，降解难溶解磷的种类以及数量受微生物本身和培养环境条件的影响。Shekhar等[27]研究表明，以解磷圈来判定菌株是否具有解磷能力及能力大小作为指标是不严谨的。本研究中也发现类似现象，如待测菌株的解磷圈大小结果都相对较好，但是其在液体培养上的解磷能力检测却表现很差，解磷效果不好或几乎没有解磷效果。因此，仅仅通过解磷圈的有无和大小来判定菌株解磷能力的大小的方法是片面的，本研究结合解磷菌液体培养基的培养结果，通过比较菌上清液可溶性磷含量检测结果，来确定菌株是否具有解磷能力，这种方法是科学有效的。(2)实验材料及采样地环境因素。由于根际促生菌具有选择差异性，此研究采样进行研究的树种不同，会造成与其他研究的结果差异，同时采样地环境因素(土壤湿度、土壤温度、土壤酸碱度、气温、海拔和空气氧含量等)也会造成结果的不同[16，28，29]。通过对以上因素的综合分析可见，要在野生中国沙棘根际土壤中筛选出高效解磷菌，有必要从温度适宜、土壤肥沃的环境中进行采样，研究方法也有必要进行不断优化，使研究结论的获得更加科学有效。