Box-Behnken优化红景天中红景天苷和酪醇的提取工艺△

李杰，左想想，张南茜，刘江齐，朱艳平，刘耀

1.河南科技大学 基础医学院，河南 洛阳 471023；2.南召县林业局，河南 南阳 474650

红景天为景天科（Crassulaceae）红景天属（Rhodiola roseaL.）多年草本或亚灌木野生植物，主要以茎和根入药。其性平，味甘、微苦，具有益气活血、通脉平喘的功效，常用于气虚血瘀、胸痹心痛、卒中偏瘫等[1]。近代研究表明，红景天苷和酪醇是红景天的主要活性组分，具有保护神经细胞、增强机体免疫力、抑制癌细胞生长、防止肝纤维化等药理作用[2-4]，被广泛应用于医药、化工、保健、食品等领域。目前常用甲醇或乙醇提取红景天苷和酪醇，甲醇或乙醇为提取溶剂存在着易燃、易爆、易挥发、溶剂残留等问题。因此需要一种绿色高效的提取溶剂来提取红景天苷和酪醇。

低共熔溶剂（DESs）是由Abbott 等[5]合成的一种新型绿色溶剂，主要由氢键受体和氢键给体两类化合物组成，具有廉价易得、难挥发、无毒、可生物降解等优点，是传统溶剂的良好替代品[6-7]。吴蓉等[8]以乙酰丙酸-乙二醇（1∶1）组成的DESs提取红景天苷和酪醇，结果表明，在搅拌速率为150 r·min–1，料液比为1.0∶2.5，提取温度为60 ℃，提取时间为65 min 时，红景天苷和酪醇的提取率最佳，分别是同等条件下水和乙醇提取率的1.2、1.1 倍。但其提取时间长，同时以价格昂贵的乙酰丙酸为氢键受体，提取成本高，因此有必要对该提取方法进行改进和完善。氯化胆碱是一种应用广泛的氢键受体，具有廉价易得、绿色环保等优点。Ali 等[9]以氯化胆碱为氢键受体，苹果酸、草酸、对甲基苯磺酸等为氢键给体制备了11 种DESs，提取枸杞中的黄酮类化合物。结果表明，氯化胆碱-对甲基苯磺酸（1∶2）组成的DESs提取效果最佳。Zhou等[10]制备了以氯化胆碱、甜菜碱及L-脯氨酸为氢键受体的12 种DESs，用以提取桑叶中的酚酸类化合物。结果显示，氯化胆碱为氢键受体，柠檬酸为氢键给体组成的DESs提取效果最佳，远优于传统的甲醇提取和水提取。Zhang等[11]以氯化胆碱为氢键受体，草酸等为氢键给体制备了6种DESs，提取茯苓多糖。发现氯化胆碱-草酸（1∶2）组成的DESs，多糖提取率是传统热水提取率的8.6 倍。因此，本研究以氯化胆碱为氢键受体，丙三醇等为氢键给体，制备了一系列的DESs，并在超声辅助的条件下提取红景天中的红景天苷和酪醇，同时运用Box-Behnken 响应面法对该提取工艺进行优化，以期为红景天中红景天苷和酪醇的快速高效提取提供一种新思路，同时为后期的红景天苷和酪醇的性能研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

BT125D 型双量程电子分析天平（德国多利斯公司）；CT14RD 型高速冷冻离心机、LC2000 型高效液相色谱仪（上海天美科学仪器有限公司）；KQ2200DE 型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；HH-420型磁力搅拌恒温水浴锅（上海力辰仪器科技有限公司）。

1.2 试药

对照品酪醇（批号：H23M10Z89089，纯度≥98%）、红景天苷（批号：C13J8Q39713，纯度≥98%）、氯化胆碱（分析纯）均购自上海源叶生物科技有限公司；尿素、丙三醇、乙二醇、1,2-丙二醇、丙二酸（天津科密欧化学试剂有限公司）均为分析纯；甲醇（天津巴斯夫分析试剂有限公司，色谱纯）。

红景天饮片（批号：20200801174）购于洛阳市，经河南科技大学基础医学院欧丽娜副教授鉴定为景天科蔷薇红景天Rhodiola roseaL.的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Kromasil-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.2% 磷酸水（18∶82）；流速：0.8 mL·min–1；进样量：20 μL；检测波长：276 nm；柱温为室温。

2.2 标准曲线的制备

精密称取红景天苷对照品12.0 mg和酪醇对照品10.0 mg 于烧杯内，甲醇溶解后，分别定容于10 mL棕色量瓶内。然后分别移取红景天苷对照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL和酪醇对照品溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，混合于10 mL棕色量瓶中。最后移取上述混合对照品溶液2.5 mL于5 mL量瓶中，18%甲醇定容，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得红景天苷和酪醇的混合对照品溶液。按2.1项下色谱条件检测，以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线。红景天苷：Y=7 178.3X–26 588（r=0.999 6）；酪醇：Y=17 606X–29 055（r=0.999 7）。红景天苷在24～120 μg·mL–1线性关系良好；酪醇在15.0～75.5 μg·mL–1线性关系良好。

2.3 DESs的制备

将氯化胆碱分别与丙三醇、尿素、乙二醇、1,2-丙二醇、丙二酸按表1 的摩尔比混合于具塞锥形瓶内，在80 ℃水浴条件下搅拌至完全溶解，取出冷却至室温，备用。

表1 DESs种类及摩尔比

2.4 供试品溶液的制备

称取红景天粉末1.0 g于具塞锥形瓶中，按照一定的液料比加入不同含水量的DESs，室温条件下超声（200 W，20 kHz）提取一定时间后，移取提取液2 mL，10 000 r·min–1离心5 min（离心半径为6.36 cm），取上清液1 mL于5 mL量瓶中，18%甲醇定容，0.45 μm微孔过滤器滤过，按2.1 项下色谱条件检测红景天苷和酪醇的含量。

2.5 响应面优化试验设计

在单因素试验的基础上，以红景天苷和酪醇的提取率为评价指标，采用Box-Behnken 响应面法对超声辅助DESs提取红景天中红景天苷和酪醇的影响因素进行优化，因素水平见表2。

表2 红景天中红景天苷和酪醇提取工艺Box-Behnken响应面试验设计因素与水平

2.6 红景天苷和酪醇提取率的计算

根据样品的红景天苷和酪醇的平均峰面积和标准曲线，按公式（1）和（2）计算红景天苷和酪醇的提取率（Y）。

式中，N为提取液的稀释倍数，V为提取液总体积，M为红景天的质量，A1为红景天苷平均峰面积，A2为酪醇平均峰面积。

2.7 DESs组成的确立

将上述制备的5 种DESs 与水（4∶1），按照液料比为20∶1 加入红景天药材粉末，在室温条件下提取20 min（图1）。由图1 可知，红景天苷和酪醇的提取率与DESs 的组成有关，其中以尿素作为氢键给体的DESs 提取率最低；丙三醇与氯化胆碱组成的DESs 提取率最高。因此，本研究将以丙三醇和氯化胆碱组成的DESs 为提取溶剂，进一步探讨超声辅助提取的最佳工艺条件。

图1 DESs种类对提取率的影响

2.8 单因素试验

2.8.1 提取时间对红景天苷和酪醇提取率的影响在含水量为20%，液料比为20∶1 的条件下，研究提取时间对红景天苷和酪醇提取率的影响，结果见图2。由图2可知，随着提取时间的延长，红景天苷和酪醇的提取率呈先升高后降低的趋势，在提取时间为30 min 时，红景天苷和酪醇的提取率最高。这可能是由于提取时间的延长，提高了植物细胞壁的破碎程度，有利于红景天苷和酪醇的溶出，但提取时间过长导致红景天苷和酪醇结构被破坏，提取率降低[12]。因此，提取时间30 min较为合适。

图2 提取时间对提取率的影响

2.8.2 含水量对红景天苷和酪醇提取率的影响 在提取时间为30 min，液料比为20∶1的条件下，研究含水量对红景天苷和酪醇提取率的影响，结果见图3。由图3 可知，随着含水量的增加，红景天苷和酪醇的提取率先升高后降低。当含水量为30%时，红景天苷和酪醇的提取率最高。这是由于含水量的升高，降低了DESs 的黏度，黏度的降低有利于提高DESs的传质效率[13]，提高红景天苷和酪醇在溶剂的扩散系数。同时，含水量的升高提高了DESs的极性。红景天苷和酪醇的极性较大，根据相似相溶原理，极性增大有利于红景天苷和酪醇的溶解。当含水量超过30%后，红景天苷和酪醇的提取率开始逐渐降低。这可能是由于含水量的增加导致DESs分子间的氢键断裂，超分子结构消失，使得红景天苷和酪醇的提取率逐渐降低[14-15]。

图3 含水量对提取率的影响

2.8.3 液料比对红景天苷和酪醇提取率的影响 在提取时间30 min，含水量为30%的条件下，研究液料比对红景天苷和酪醇提取率的影响，结果见图4。由图4 可知，随着液料比的增加，红景天苷和酪醇的提取率先增大后逐渐降低。这可能是由于液料比的升高使物料与溶剂接触更加充分，促进了红景天苷和酪醇的溶出，因此提取率升高。但当液料比超过40∶1 时，过多的提取溶剂削弱了超声波的能量，使超声波不能有效地破坏植物细胞壁[16-17]，导致红景天苷和酪醇的溶出量减少，提取率降低。

图4 液料比对提取率的影响

2.9 Box-Behnken响应面法优化

2.9.1 Box-Behnken 试验结果与方差分析 根据Box-Behnken 设计原理，以提取时间（A）、含水量（B）和液料比（C）为自变量，以红景天苷提取率（Y1）为主，酪醇提取率（Y2）为辅，进行三因素三水平的响应面试验设计。结果见表3。

表3 红景天中红景天苷和酪醇提取工艺Box-Behnken试验设计和结果

利用Design Expert 8.0.6软件对表3中的试验结果进行回归拟合分析，得到二次回归方程：Y1=–3.54+0.0301A+0.240B+0.406C+0.00268AB–0.00168AC–0.000 450BC–0.005 18A2–0.005 81B2–0.004 56C2；Y2=–3.19+0.0338A+0.191B+0.930C–0.000475AB+0.00180AC+0.00153BC–0.000125A2–0.00392B2–0.00260C2。

由表4 可知，回归方程的一次项和二次项极显著，说明各因素对响应值不是简单的一次线性关系。该模型的P<0.000 1，表明建立的数学模型具有极显著性，回归方程能很好地模拟真实曲面，方法可靠；失拟项P=0.556 4>0.05 不显著，说明该数学模型的拟合度较好[18]。模型中一次项B、C，二次项A2、B2和C2对红景天苷提取率的影响极显著（P<0.001），交互项AB 红景天苷提取率的影响非常显著（P<0.01），交互项AC 红景天苷提取率的影响显著（P<0.05），模型复合相关系数（R2）=0.986 7、校正决定系数（R2Adj）=0.969 6，表明可用该数学模型和二次回归方程来分析和预测红景天苷的提取率[19]。由各因素的F值可知B>C>A，说明含水量对红景天苷提取率的影响最大，其次为液料比，提取时间影响最小。由表5 的酪醇方差分析结果可知，建立的数学模型P=0.001 2<0.01，失拟项P=0.062 5>0.05 表明建立的数学模型达到非常显著水平。一次项A、C和二次项C2酪醇提取率的影响非常显著；交互项AC、BC 酪醇提取率的影响显著。酪醇数学模型的R2和R2Adj分别为0.945 2、0.874 8。由各因素的F值可知，提取时间对酪醇的提取率影响最大，其次为液料比，含水量影响最小。

表4 红景天苷提取率方差分析结果

表5 酪醇提取率方差分析结果

2.9.2 响应曲面拟合及最优条件确立 利用Design Expert 8.0.6 软件得到红景天苷和酪醇的响应面图（图5）。由图5 可知，红景天苷和酪醇的响应面均为开口向下的凸形曲面，说明在选定的区域内，红景天苷和酪醇的提取率存在极大值。从图5中可直观地看出，含水量的曲面最为陡峭，对红景天苷提取率的影响最大[20]，其次为液料比和提取时间，与方差分析结果吻合。响应面在底面上的投影为等高线图，等高线图的形状反映了两因素交互作用对提取率的影响，圆形代表不显著，椭圆代表影响显著[21]。由图5中的等高线图可知，提取时间和含水量的等高线图呈椭圆形，因此对红景天苷的提取率的影响最为显著。同理，由图5 可知，提取时间对酪醇提取率影响最大，提取时间和液料比交互作用对酪醇提取率的影响最显著。经Design Expert 8.0.6 软件优选的红景天苷最佳提取条件为提取时间29.64 min，含水量26.07%，液料比37.86∶1.00，理论提取率为11.74 mg·g–1。酪醇的最佳提取条件为提取时间36.26 min，含水量29.77%，液料比39.24∶1.00，理论提取率为2.08 mg·g–1。

图5 提取时间、含水量及液料比对红景天中红景天苷和酪醇提取率影响的响应面和等高线图

2.9.3 验证实验 由于红景天苷是红景天的特征组分且含量较高，因此对优化得到的红景天苷提取条件进行了验证。为了方便操作将红景天苷提取的最佳条件修正为提取时间30 min，含水量26%，液料比38∶1，进行3 次平行实验。结果表明，在此条件下红景天苷和酪醇的平均提取率分别为11.64、2.02 mg·g–1，与预测值基本相符。说明基于Box-Behnken 响应面法建立的回归方程和数学模型稳定可靠，优选的工艺参数准确可靠，具有一定的实际参考价值。

3 结论

近年来，应用超声辅助技术提取中药材中活性组分受到了研究者的广泛关注[22-23]。超声辅助提取主要是利用超声波产生的空化效应、机械效应以及热效应，提高物质分子的运动频率和速度，促进细胞壁的破裂，从而使细胞内容物快速溶出，达到快速、高效提取的目的。因此，与传统的热回流提取、煎煮提取等方法相比，超声辅助提取可有效保障活性组分从中药材中快速溶出，同时避免了长时间加热而导致失活。本研究以氯化胆碱为氢键受体，尿素、乙二醇、丙二酸、1,2-丙二醇、甘油为氢键给体，制备了5 种绿色环保的DESs。通过对比发现，在超声辅助下氯化胆碱-丙三醇组成的DESs 提取红景天苷和酪醇效果最佳。在此基础上，采用设计方法简单、可信度较高的Box-Behnken 设计对超声辅助DESs 提取工艺进行了优化，建立了红景天苷和酪醇与提取时间、含水量及液料比之间的多元数学统计模型。确立了红景天苷和酪醇提取的最佳工艺参数，即提取时间30 min，含水量26%，液料比38∶1，在此条件下红景天苷和酪醇的提取率分别为11.64、2.02 mg·g–1，与数学模型预测值基本相符，表明建立的数学模型稳定、可靠，得到的最佳提取工艺条件具有一定的实际应用价值，可为红景天苷和酪醇的快速高效提取提供参考，同时可为红景天的质量控制和综合开发利用提供借鉴。