食管鳞状细胞癌中ZNF24蛋白的表达及其预后价值

陈 晔，蒋冬先，刘玉凤，宋 琦，徐 磊，宿杰阿克苏，侯英勇

复旦大学附属中山医院病理科，上海 200032

食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，包括食管鳞状细胞癌（ESCC）和食管腺癌（EAC）。ESCC是中国最常见的食管癌组织类型。尽管治疗水平不断提高，但ESCC的5年生存率仍低于20%。目前认为ESCC发病的高危因素包括遗传因素、饮食因素和环境因素［1-2］。研究［3-4］表明，TP53、RB1和NOTCH1等 基 因 在ESCC中 发 挥着重要作用。肿瘤的发生是一个多基因、多步骤的过程，所以本研究主要探讨是否有其他基因影响ESCC的预后。锌指蛋白24（ZNF24）也称为ZNF191或KOX17，在胚胎发育和成人组织中广泛表达［5-6］。研究［7-8］发现，敲除ZNF24会导致发育过程中胚胎的过早死亡，说明ZNF24在器官发育过程中起着重要作用。除了调节正常细胞的功能，ZNF24在癌症起始和进展的关键过程中发挥重要作用，如参与调控肝细胞癌和胃癌的增殖、分化、迁移和侵袭。然而，ZNF24在ESCC中的分子作用和临床意义尚不清楚。因此，本研究利用组织芯片采用免疫组织化学（IHC）法检测513例ESCC中ZNF24蛋白的表达，旨在探讨其表达与临床病理因素的关系及其对ESCC患者的预后预测价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2007年—2010年复旦大学附属中山医院胸外科手术切除的ESCC标本513例。所有患者术前未行放疗、化疗。H-E切片由两位病理医师独立确认ESCC诊断，临床病理参数：年龄，性别，肿瘤大小（以3 cm分为两组），肿瘤位置（食管上段、中段及下段），吸烟史，分化程度（高、中、低），浸润深度（Ⅰ：局限于黏膜下层、Ⅱ：侵犯肌层、Ⅲ：突破肌层），脉管及神经侵犯与否，淋巴结转移和临床分期（分Ⅰ+Ⅱ、Ⅲ+Ⅳa两组）。本研究获复旦大学附属中山医院伦理委员会批准（B2021-178R）。所有患者或家属均签署书面知情同意书。

1.2 组织芯片（TMA）的制备 选取H-E切片中具有代表性的区域，从每例蜡块中取出宽2 mm、长6 mm的组织垂直放置于新的蜡块中，制作组织芯片，每个组织芯片包含70个病例。

1.3 IHC检测 TMA取4 μm切片，脱蜡至水，抗原修复液（pH 9.0）中加热10 min。一抗为ZNF24（稀释比1∶50，Abcam公司），使用全自动免疫组化染色机Aliya进行免疫组化Compact Polymer法染色。

1.4 结果判读 ZNF24染色阳性标准为细胞核出现棕黄色或棕褐色颗粒。TMA中ZNF24的表达情况由两位病理医师独立评估。IHC评分标准：无阳性染色为0分；弱染色为1分；弱到中度染色为2 分；中度到强染色为3分。分别统计阳性细胞比例，计算H-score评分（强度×阳性细胞比例）。

1.5 随 访 513例患者的随访资料来自于病历记录、电话随访和家访。随访时间截至2018年12月。无病生存期（disease free survival, DFS）和总生存期（overall survival，OS）是从手术时间到首次复发时间（最后随访时间）或死亡时间计算。

1.6 统计学处理 计数资料间的比较采用χ2检验及Fisher确切概率检验，Kaplan-Meier法进行生存分析，生存期间的比较采用Log-rank检验。使用Cox回归模型进行单因素和多因素生存分析。所有数据采用SPSS 22.0版本, 检验水准（α）为0.05。

2 结果

2.1 临床病理特征 513例（男性420例，女性93例）ESCC患者平均年龄为61.2岁（34～83岁）。201例有吸烟史。295例肿瘤直径小于3 cm，218例肿瘤直径大于3 cm。肿瘤位置以中下段为主。96.5%的病例为中、低分化。肿瘤的浸润深度多侵及肌层及外膜层。115例（22.4%）存在脉管癌栓，178例（34.7%）存在神经侵犯，239例（46.6%）出现淋巴结转移。依据第8版AJCC分期标准，281例（54.8%）为临床Ⅰ＋Ⅱ期，232例（45.2%）为临床Ⅲ＋Ⅳa期。513例ESCC患者中，5个临床病理参数与较差的预后具有明显相关性，分别为浸润深度（DFS，P＜0.001；OS，P＜0.001）、脉管侵犯（DFS，P＝0.001；OS，P＝0.001）、神经侵犯（DFS，P＝0.001；OS，P＝0.004）、淋巴结转移（DFS，P＜0.001；OS，P＜0.001）和临床分期（DFS，P＜0.001；OS，P＜0.001）。

2.2 ZNF24蛋白的表达及其与临床病理参数的相关性 ZNF24蛋白阳性表达呈棕黄色或棕褐色，定位于细胞核（图1）。为了选择最佳的界限值，本研究根据生存状态绘制受试者工作特征（ROC）曲线，确定以评分1.5为阈值，分为低表达组（135例，26.3%）和 高 表 达 组（378例，73.7%）。ZNF24表达与患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤分化程度、浸润深度、脉管与神经侵犯与否、淋巴结转移和临床分期无明显相关性，但与肿瘤大小显著负相关（P＜0.001），和肿瘤位置显著正相关 （P＝0.038，表1）。

图1 食管鳞状细胞癌中ZNF24的蛋白表达A：ZNF24低表达；B：ZNF24高表达。Original magnification：× 100。

表1 513例ESCC患者中ZNF24表达与临床病理特征的关系

2.3 ESCC患者的生存分析 患者的中位随访时间为35个月（3～102个月），DFS和OS的5年生存率分别为68.6%和68.0%。DFS的平均随访时间和中位随访时间分别为41.2个月和30个月，OS的平均随访时间和中位随访时间分别为44.5个月和35个月。

ZNF24高 表 达 组 的DFS（P＝0.524）和OS （P＝0.527）均比ZNF24低表达组缩短，但差异无统计学意义。观察DFS和OS的生存曲线，分别于28个月及35个月后差异逐渐明显。进一步分析发现，当DFS大于28个月时，ZNF24高表达组生存期显著缩短（P＝0.035）；当OS大于35个月时，ZNF24高表达组生存期显著缩短（P＝0.036，图2）。

图2 Kaplan-Meier分析DFS和OS与ZNF24蛋白表达的关系A、B：在513例ESCC患者中，ZNF24高表达组的DFS和OS 预后均较差；C：275例DFS≥28个月的ESCC患者中，ZNF24高表达组预后比低表达组显著变差（P＝0.035）；D：261例OS≥35个月的ESCC患者中，ZNF24高表达组预后比低表达组显著变差（P＝0.036）。

单因素生存分析发现，肿瘤浸润深度、脉管及神经侵犯、淋巴结转移和临床分期与DFS（表2）和OS（表3）相关；多因素生存分析发现，浸润深度和淋巴结转移是患者独立预后因子，ZNF24蛋白高表达并不是ESCC的独立预后因子。

表2 单因素和多因素Cox回归模型分析与ESCC患者DFS相关的危险因素

表3 单因素和多因素Cox回归模型分析与ESCC患者OS相关的危险因素

3 讨论

ZNF24是类Kruppel锌指基因家族的一员，其N端含有1个SCAN结构域，SCAN结构域由富含亮氨酸区域组成高度保守的模体，用来调节与其他含有SCAN结构域的蛋白质之间相互作用［9］。ZNF24被认为是一种调控细胞生长、分化和发育的蛋白质［10］，参与胚胎发育［7］和造血［11］，并被证明在癌症的发生发展过程中发挥重要作用［12］。

ZNF24在不同的恶性肿瘤中有着完全不同的表达模式和肿瘤相关作用。在肝细胞癌中，ZNF24的表达高于正常肝组织，可直接与β-catenin启动子结合促进细胞增殖［13］。ZNF24还可增加WNT8B启动子在肝细胞癌中的转录活性，从而上调WNT8B的转录和蛋白表达，进而通过Wnt信号通路促进肿瘤细胞增殖［14］。尽管ZNF24有促增殖的作用，但能够抑制肝细胞癌的转移［15］。在三阴性乳腺癌中，ZNF24表达上调，microRNA-940通过直接靶向ZNF24，在细胞增殖和迁移中起肿瘤抑制作用［16］。Jia等［17］发现，ZNF24通过直接结合VEGF近端启动子，作为肿瘤血管生成的负调控因子，从而抑制VEGF转录。ZNF24的异常表达同时也在胶质母细胞瘤中被发现，并显示出预后预判意义［18］。

然而，ZNF24在ESCC中的作用仍不清楚。本研究发现ZNF24在513例ESCC中蛋白过表达，阳性率为73.7%。这与ZNF24在前列腺癌组织和细胞系中均过表达的结果一致［6］。ZNF24位于染色体18q12.1，在直肠癌中该区域经常缺失，提示ZNF24在肿瘤生长中可能起负调控作用［19-20］。本研究还发现，ZNF24蛋白高表达与ESCC的肿瘤大小具有显著的负相关性。

同时，本研究发现ZNF24高表达的患者有预后较差的趋势（DFS，P＝0.524；OS，P＝0.527），尤其是当DFS大于28个月时，ZNF24高表达患者生存期显著缩短（P＝0.035）。当OS大于35个月时，ZNF24高表达患者生存期也显著缩短（P＝ 0.036），该结果提示ZNF24可能是ESCC预后不良的重要参考指标。这表明ESCC中ZNF24基因表达的调控途径可能与肝癌不同。笔者猜想，ZNF24在肿瘤手术切除后，或在不同的微环境下，基因的表达不同，ZNF24在恶性肿瘤中的双重作用可能与其多个锌指区域相关。人群、检测方法及临界值的差异也是潜在的原因。这些结果表明，ZNF24在不同的组织中扮演着不同的角色，可能是ESCC的药物靶点之一。

本研究首次报道了ZNF24与ESCC的预后关系，但主要侧重于阐明其临床意义，并未在分子水平上充分探讨其作用机制，进一步研究其信号通路将为一种新的药物靶点提供可能。本研究表明ZNF24在ESCC中蛋白过表达，高表达的患者DFS和OS预后均较差，尤其是当DFS大于28个月和OS大于35个月时，ZNF24是ESCC预后不良的重要参考指标。

利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。