circ-0008583结合EIF4A3蛋白促进肝癌细胞增殖并抑制其凋亡

吴田方 戴东 王常元

1黔南州人民医院肝胆外科（贵州黔南 558000）；2天津医科大学肿瘤医院分子影像及核医学诊疗科（天津 300000）；3贵州省人民医院肝胆外科（贵阳 550000）

肝细胞癌（HCC）是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，是全球肿瘤相关死亡第四大常见原因［1］，是中国肿瘤相关死亡的第二大常见原因［2］。随着索拉非尼和免疫检查点抑制剂等新药的发展，HCC 患者生存期显著延长，但是HCC 患者的5年生存率依然很低［3-4］。因此，迫切需要探索HCC的分子机制，以确定新的诊断生物标志物和治疗靶点。

环状RNA（circRNA）在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用。如：circ-RPPH1 调节miR-146b-3p/E2F2 通路促进乳腺癌细胞的生长和转移［5］；在非小细胞肺癌中circ-MYBL2 海绵吸附miR-28 进而抑制癌细胞增殖并促进细胞凋亡［6］；在肝细胞癌中circRNA-5692 通过海绵吸附miR-328-5p 上调DAB2IP 表达抑制肝细胞癌的恶性进展［7］；circ-FN1通过海绵吸附miR-1205 和调节E2F1 的表达介导肝癌细胞对索拉非尼的耐药［8］。这些研究表明circRNA 在肿瘤的发生发展及耐药中发挥重要作用。本研究发现circ-0008583 在肝细胞癌中高表达，通过干扰circ-0008583 表达，探索其对HCC 细胞增殖和凋亡的影响，为肝细胞癌的临床治疗提供新的思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人肝永生化细胞（THLE-2）购自上海弘顺生物科技有限公司；人高转移性肝癌细胞（MHCC97-H）购自通派（上海）生物科技有限公司；人肝癌转移细胞株（HCCLM3）购自南京赛泓瑞生物科技有限公司；人肝癌细胞株（Huh-7）购自中科院（上海）细胞库；HCC-2 购自舜冉（上海）生物科技有限公司；BEGM 培养基购自赛因百奥生物技术（北京）有限公司；RPMI-1640 培养基、DMEM培养基、胎牛血清（FBS）购自Thermo Fisher Scientific（中国）；protein A/G 免疫沉淀磁珠购自bimake生物科技有限公司（美国）；RNase R 购自广州吉赛生物科技股份有限公司；放线菌素D 购自南京罗迈美生物科技有限公司；EIF4A3 兔单克隆抗体、GAPDH 兔多克隆抗体、IgG 兔多克隆抗体、U2AF65兔多克隆抗体以及辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔免疫球蛋白IgG 二抗均购自Abcam（美国）。人肝癌及癌旁组织由黔南州人民医院提供，本研究由黔南州人民医院伦理委员会批准，已告知患者知情并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 THLE-2 用含10%FBS 和1%青/链霉素的BEGM 培养基，MHCC97-H 用含10%FBS和1%青/链霉素的RPMI-1640 培养基，HCCLM3、Huh-7 以及HCC-2 用含10%FBS 和1%青/链霉素的DMEM 培养基进行培养。将细胞放在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，每2 ～3 天更换一次培养基，待细胞处于对数生长期时进行后续实验。

1.2.2 细胞转染 从将处于对数生长期的细胞接种在细胞培养板中，待细胞融合度达到80%的时候，按照脂质体LipofectamineTM2000 试剂盒说明书将circ-0008583 siRNA 及其阴性对照转染到对应细胞分组中，并通过qRT-PCR 检测转染效率。

1.2.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR） 按照Trizol（Invitrogen）试剂说明书的方法从各处理组的细胞中提取总RNA，Q3000 超微量核酸蛋白检测仪（Quawell Technology）检测RNA 的纯度和浓度。反转录系统试剂盒合成cDNA，并按照制造商说明书提供的方法使用SYBR Green 进行qRT-PCR 实验。circ-0008583 以18 s 为内参，EIF4A3、U2AF65、DLG1 以GAPDH 为内参进行归一化处理，并通过2-ΔΔCt值来计算各组细胞中目的基因的相对表达水平。实验所用引物见表1。

表1 实验室所用引物序列Tab.1 Sequence of primers used in the laboratory

1.2.4 环状RNA 稳定性检测 按照RNase R 试剂使用说明书，配置RNase R 反应液，37 ℃消化RNA 15 min，70 ℃处理10 min 使RNase R 灭活，qRT-PCR实验检测circ-0008583、DLG1的表达水平。用2 μg/mL 的放线菌素D 处理细胞6、12、18、24 h 后，按照1.2.3方法提取细胞总RNA，qRT-PCR实验检测circ-0008583、DLG1 的表达水平。

1.2.5 克隆形成实验 将转染24 h 后的各组细胞移植到6 孔板当中（每孔500 个细胞）。培养箱中37 ℃培养2 周后，甲醇固定15 min，然后用0.1%结晶紫染色，在显微镜下观察、拍照并计数。

1.2.6 TUNEL 染色 将处理后各组细胞用4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗涤1 次后，加入含0.1%Triton X-100 的PBS，冰浴孵育2 min。PBS 洗涤2 次后，加入TUNEL 检测液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗涤后，用抗荧光猝灭封片液封片后荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.7 RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验 收集各组细胞，加入等体积细胞裂解液冰浴裂解5 min后，收集裂解物。重悬protein A/G 免疫沉淀磁珠，NT-2 buffer 洗涤磁珠2 次 后，加 入EIF4A3 以 及U2AF65 抗体以及阴性对照IgG，室温混悬1 h，弃去上清，在NT-2 buffe 重悬的磁珠中加入细胞裂解液，使用垂直混合器在4 ℃条件下孵育过夜。加入NT-2 洗涤磁珠后，蛋白酶K 消化后提取RNA 进行后续分析。本实验所用溶液均不含RNA 酶。

1.2.8 蛋白质免疫印迹（Western blot） 收集各组细胞，用预冷的全蛋白裂解液冰浴10 min 裂解细胞，提取总蛋白。BCA 蛋白定量试剂盒进行定量分析，取50 μg 蛋白在100 V 条件下SDS-PAGE凝胶电泳1.5 h。在60 V 条件下转膜2 h，将分离的蛋白转到PVDF 膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h 后，加入一抗4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤2 ～3 次后，加入HRP 标记的二抗室温孵育2 h，加入ECL 反应液进行发光反应，化学发光仪下观察并拍照。

1.2.9 统计学方法 所有实验均进行3次平行实验，并用GraphPad Prism8.0 进行统计学分析，两组间比较采用独立t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circ-0008583 在肝癌组织及细胞中高表达 在GSE94508 芯片数据中，和正常组织相比，circ-0008583 在肝癌组织中高表达；在我院收集的30 例癌及癌旁组织中发现，和癌旁组织相比，circ-0008583在肝癌组织中高表达（t=56.74，P＜0.001）；在肝癌细胞系中，和人肝永生化细胞THLE-2相比，circ-0008583 在肝癌细胞（MHCC97-H、HCCLM3、Huh-7、HCC-2）中高表达（MHCC97-H：t= 22.92，HCCLM3：t=9.40，Huh-7：t=25.46，HCC-2：t=5.06，P＜0.01）。由于circ-0008583 在MHCC97-H、Huh-7细胞中表达最高，故而选择这两种细胞进行下一步研究。

2.2 circ-0008583 的circRNA 特 性验证 RNase R能够降解线性RNA，故而多用RNase R 处理验证circRNA的环状特性。在MHCC97-H、Huh-7细胞中，用RNase R 处理显著降低DLG1 mRNA 的表达水平（MHCC97-H：t= 9.16，Huh-7：t=9.79，P＜0.001），而对circ-0008583 的表达水平无影响（P＞0.05）。circRNA 的环状结构使其稳定性大大增加。在MHCC97-H、Huh-7细胞中，与circ-0008583 相比，放线菌素D 处理加速DLG1 mRNA 降解（MHCC97-H：t= 11.30，Huh-7：t=21.10，P＜0.001）。

2.3 干扰circ-0008583 抑制肝癌细胞增殖、促进凋亡 circ抑制组显著降低MHCC97-H、Huh-7细胞中circ-0008583的表达水平（circ抑制组1：t=12.77，circ 抑制组2：t= 21.40，circ 抑制组3：t= 17.25，P＜0.001），其中circ 抑制组2 抑制效果最为显著（图1A-B），故而选择其进行下一步实验。见图1C-D，和阴性对照组相比，circ 抑制组2 的细胞克隆数降低（MHCC97-H：t=8.49，Huh-7：t=6.19，P＜0.01）。见图1E-F，和阴性对照组相比，circ 抑制组2 细胞凋亡水平升高（MHCC97-H：t= 14.18，Huh-7：t=19.38，P＜0.001）。

图1 干扰circ-0008583 抑制肝癌细胞增殖、促进凋亡Fig.1 Interference with CIRC-0008583 can inhibit the proliferation and promote apoptosis of HCC cells

2.4 circ-0008583 与EIF4A3 互相结合 通过检索Circular RNA Interactome 数据库（https：//circinteractome.irp.nia.nih.gov/）发现circ-0008583能够与EIF4A3和U2AF65 结合。RIP 实验证实，在MHCC97-H、Huh-7 细胞中circ-0008583 均与EIF4A3 和U2AF65结合（图2）。

图2 circ-0008583 与EIF4A3 互相结合Fig.2 circ-0008583 is combined with EIF4A3

2.5 EIF4A3在肝癌组织和细胞中高表达 在我院收集的30 例肝癌及癌旁组织中，与癌旁组织相比，EIF4A3 在癌组织中高表达（t= 43.15，P＜0.001）。qRT-PCR 实验和western blot 实验发现，与THLE-2细胞相比，EIF4A3 在肝癌细胞系（MHCC97-H、HCCLM3、Huh-7、HCC-2）中高表达（EIF4A3 mRNA：MHCC97-H：t= 22.19，HCCLM3：t= 14.24，Huh-7：t=14.81，HCC-2：t=5.00，均P＜0.001）。

2.6 过表达EIF4A3 逆转干扰circ-0008583 对肝癌细胞增殖、凋亡的影响 见图3A，在MHCC97-H 细胞中，circ抑制组2降低EIF4A3的蛋白表达水平；同时过表达EIF4A3 则在一定程度上提高EIF4A3 蛋白表达（t= 5.80，P＜0.001）。见图3B，circ抑制组2降低MHCC97-H 细胞的克隆形成能力（t= 10.59，P＜0.001），而过表达EIF4A3 使细胞克隆形成能力得到一定程度的回复（t=5.48，P＜0.001）。见图3C，circ抑制组2促进MHCC97-H细胞的凋亡（t=24.08，P＜0.001），而过表达EIF4A3 使细胞凋亡得到一定程度的抑制（t=7.33，P＜0.001）。

图3 过表达EIF4A3 逆转干扰circ-0008583 对肝癌细胞增殖、凋亡的影响Fig.3 Overexpression of EIF4A3 reverses the effect of circ-0008583 on proliferation and apoptosis of HCC cells

3 讨论

circRNA 是一类生物体内广泛存在、稳定且保守的非编码RNA，通过其3′和5′末端的反向剪接形成共价环状闭合结构［9］。由外显子、内含子、外显子-内含子等多种方式环化形成，通过调节可变剪接、RNA-蛋白质相互作用、海绵吸附miRNA 等多种方式进一步发挥其分子作用［10-12］。circRNA 广泛参与肿瘤的发生发展，是肿瘤潜在的生物标志物和治疗靶点［13-14］。关于circ-0008583 在肝癌中的作用机制仍需要研究。本研究发现，circ-0008583在肝癌组织和细胞中高表达。由于circRNA 特殊的环状结构，使具有更强的稳定性。用RNase R处理RNA，发现circ-0008583 不被降解，证实circ-0008583 具有环状结构。进一步通过放线菌素D处理RNA，发现circ-0008583 的稳定性远远高于DLG1 mRNA。为了明确circ-0008583在肝癌细胞中的分子功能，进一步实验证实干扰circ-0008583 表达抑制肝癌细胞增殖，促进细胞凋亡。最近也有报道称Has_circ_0008583 影响肝癌恶性进展，其机制可能与miR-1301-3p/METTL3通路有关［15］。circRNA能够通过与RNA结合蛋白结合，进而调控肿瘤细胞凋亡和周期组织［16-17］。因此推测circ-0008583 可能有类似的调控作用。通过生物信息学数据挖掘发现circ-0008583 能够和EIF4A3 和U2AF65 结合，并通过RIP 实验证实circ-0008583 与两个蛋白都能够结合。由于EIF4A3 中circ-0008583 的富集程度最高，故而选择其进一步探索。EIF4A3 是EIF4A 真核翻译起始因子家族成员之一，转录后修饰蛋白的表达［18］。本研究发现EIF4A3 在肝癌组织及细胞系中高表达，和其他研究保持一致。而在干扰circ-0008583 表达的同时过表达EIF4A3，发现其能逆转干扰circ-0008583 表达对肝癌细胞系增殖抑制作用和凋亡的促进作用。EIF4A3 在肿瘤的恶性进展中发挥重要作用，如在结直肠癌中，circCSE1L 与EIF4A3 结合下调PCNA 表达，抑制了结直肠癌细胞的增殖［19］；此外，在肝癌中，EIF4A3高表达和肝癌患者预后不良相关；长链非编码RNA CASC11 通过EIF4A3介导E2F1激活促进肝癌发生和HCC恶性进展［20］；circ_0072995通过调节miR-1253/EIF4A3 信号促进肝癌细胞的增殖和侵袭［21］。

本研究通过生物信息学分析、临床组织及细胞系验证，发现circ-0008583 在肝癌组织及细胞系中高表达。体外功能实验发现干扰circ-0008583表达抑制肝癌细胞增殖、促进细胞凋亡。分子机制研究表明circ-0008583 与EIF4A3 结合，进而促进肝癌细胞增殖、抑制细胞凋亡。然而circ-0008583 和EIF4A3 在肝癌细胞中的作用机制仍然需要在体内实验中进一步的验证，该研究为肝癌的治疗提供新的治疗思路和理论依据。