基于玻璃体液代谢物的水中大鼠淹没时间推断

张富源，王林林，3，张 淼，3，董雯雯，3，张忠铎，李新杰，马星宇，杜书奎，袁浩淼，官大威，3，赵锐，3

1.中国医科大学法医学院 法医司法鉴定中心，辽宁 沈阳 110122；2.智慧司法鉴定联合实验室，辽宁 沈阳 110122；3.辽宁省法医学生物证据重点实验室，辽宁 沈阳 110122

水中尸体的鉴定一直是法医工作中的重点及难点，实践中需要明确水中尸体的死亡时间（postmortem interval，PMI）以及死亡原因等问题。死后淹没时间（postmortem submersion interval，PMSI）是指水中尸体从入水到被发现所经历的时间[1]，与其PMI 基本一致，常用于衡量水中尸体的死亡时间。有研究[2-3]提出，采用腐败程度总评分（total aquatic decomposition score，TADS）结合累积日度（accumulated degree day，ADD）的方法推断水中尸体PMSI，但该方法易受主观因素影响，且不适用于早期水中尸体[4-5]。另外，尽管硅藻检验被认为是诊断溺死的“金标准”，但其存在假阳性和假阴性[6-7]。因此，建立或寻找具有较高准确性及特异性的方法或指标用于早期水中尸体PMSI 推断及死因鉴别是亟须解决的法医病理学科学问题。

代谢组学是一个新兴的组学技术应用领域，专门检测机体在疾病或者外界刺激状态下体内组织或体液中小分子代谢物的变化情况[8]。随着相应仪器性能的提高和代谢组学方法的发展，越来越多的学者认识到深入了解机体死后代谢过程的变化对于准确推断PMI的重要性[9-11]。由于溺水过程涉及复杂的病理生理过程及机制[12]，而且机体在死亡后体内多种生化过程因缺氧而中断，代谢物发生不可逆的变化[13]。从整体角度分析机体的代谢变化不仅有助于深入了解溺死的病理生理过程，而且对探索水中尸体死后代谢谱变化规律与淹没时间和死亡原因的关系具有重要意义。

近些年，国内外法医学者针对血液、玻璃体液、房水、脑脊液、心包液及滑膜液等进行了尸体死后代谢和生物化学研究[14-18]，其中玻璃体液由于解剖位置特殊，不易被破坏污染，是较为理想的研究检材[19]。本研究拟建立大鼠溺死及死后即刻入水模型，通过LCMS/MS 代谢组学方法检测死亡早期水中大鼠尸体玻璃体液中的小分子代谢谱，运用多元统计分析及机器学习算法探索代谢物的变化规律及差异，以期为水中尸体早期PMSI 推断及死因鉴别提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

Q ExactiveTMHF-X 质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司），VanquishTMNeo UHPLC 系统（美国Thermo Fisher Scientific 公司），Hypesil GoldTMC18选择性HPLC 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm；美国Thermo Fisher Scientific 公司），D3024R 低温离心机（美国Scilogex 公司）。

甲醇（色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific 公司），水（色谱纯，美国Merck 公司），甲酸（色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific 公司），醋酸铵（色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 实验动物及分组

健康成年雄性SD 大鼠100 只，体质量230～270 g，由中国医科大学实验动物部提供。将大鼠适应性饲养于温度（25±2）℃、相对湿度45%～55%、光照/黑暗12 h 交替的环境中，自由进食饮水。饲养1 周后进行实验，实验地点为辽宁省沈阳市沈北新区冬雪湖（N41°963′，E123°479′），水体为淡水湖泊，于夏季（6 月）开展实验，整个实验期间湖水温度为20 ℃～25 ℃。本研究获得中国医科大学动物伦理学委员会审核批准（审批号CMU2019242）。

将SD 大鼠随机分为溺死组和死后即刻入水组，每组50 只。溺死组大鼠参照WANG 等[20]方法制作大鼠溺死模型，将大鼠置于无菌网袋内，按照自然湖水中淹没1 min、水上呼吸30 s 的步骤循环，直至大鼠死亡，死亡后将其置于自然湖水中淹没（约水下0.5 m）。对死后即刻入水组大鼠采用二氧化碳（CO2）气体窒息处死后浸入湖水相同水深处。于死后固定时间点0、6、12、18 及24 h，在每组中提取10 只大鼠的双侧眼球玻璃体液，取材后立即将样本置于液氮中速冻，随后于-80 ℃保存备检。每组每个时间点内取8 只大鼠的样本用于训练集模型构建，2 只大鼠的样本作为测试集样本。其中死后即刻入水（0 h）组有2 只大鼠玻璃体液取材失败，本研究共98 份玻璃体液样本。

1.3 样本处理

抽取50 μL 玻璃体液样本置于微量离心管中，加入200 μL 质谱级甲醇沉淀蛋白，涡旋振荡后冰浴静置5 min，于4 ℃下，15 000×g离心10 min。移取100 μL上清液至新的微量离心管中，加入质谱级水稀释至甲醇含量为53%，并于4 ℃下，15 000×g离心10 min，收集上清液，上机进行分析。从每个实验样本中取等体积样本混匀作为质量控制（quality control，QC）样本，用于平衡色谱-质谱系统和监测仪器状态，在整个实验过程中对系统稳定性进行评价。以53%甲醇水溶液代替实验样本作为空白样本，用于去除背景离子。QC 样本和空白样本处理过程与实验样本相同。

1.4 LC-MS/MS 检测

色谱条件：Hypesil GoldTMC18 选择性HPLC 色谱柱，柱温40 ℃，流速0.2 mL/min。阳离子模式流动相A 为0.1%甲酸溶液，流动相B 为甲醇；阴离子模式下流动相A 为5 mmol/L 醋酸铵，pH 值9.0，流动相B 为甲醇；流动相及梯度洗脱程序见表1。

表1 LC-MS/MS 仪器的色谱柱梯度洗脱程序Tab.1 Column gradient elution procedure for LC-MS/MS instruments

质谱条件：质谱扫描范围m/z为100～1 500，喷雾电压3.2 kV，鞘气流速35 mL/min，辅助气流速为10 mL/min；离子传输管温度320 ℃；极性为阳离子模式、阴离子模式；MS/MS 二级扫描模式为数据依赖型扫描。

1.5 数据处理与分析

1.5.1 数据预处理

将原始数据文件导入Compound Discoverer 3.1软件（美国Thermo Fisher Scientific 公司），进行保留时间、质荷比等参数的筛选，然后对不同样本根据保留时间偏差0.2 min 和质量偏差5×10-6进行峰对齐。根据质量偏差5×10-6、信号强度偏差30%、信噪比3、最小信号强度100 000、加和离子等信息进行峰提取，同时对峰面积进行定量，整合目标离子，然后通过分子离子峰和碎片离子进行分子式预测，并与mzCloud（https：//www.mzcloud.org/）和mzVault、MassList 本地数据库进行比对，采用空白样本去除背景离子，对定量结果进行归一化，最终得到各种代谢物的定性定量检测结果，以Excel 格式（.xls）输出并保存。为便于数据分析，将阳离子模式及阴离子模式下所得代谢物定性定量结果合并。

1.5.2 统计分析

将数据预处理所得结果导入SIMCAP 14.1 软件（瑞典Umetrics 公司）中进行PCA 及PLS 分析，探究不同PMSI 及不同死因间玻璃体液样本的代谢谱差异。PCA 是一种在没有样本分组信息的情况下对样本进行无监督分析的方法，常用于观察实验样本和QC 样本的自然聚类趋势[21]，依此确定实验是否稳定。PLS是基于已知样本的分组信息进行模式识别的有监督多元统计方法，常用于模型建立及寻找组间差异，并采用交叉检验和置换检验来验证模型的可靠性[22]。PLS 可应用于分类及回归问题，当应用于分类问题时称作PLS-判别分析（discriminant analysis，DA）。PLS回归及PLS-DA 经交叉检验得到验证参数为R2X、R2Y、Q2Y。R2X为模型对自变量X数集上的解释能力，R2Y为模型对因变量Y数集上的解释能力，Q2Y表示模型的预测能力，R2Y、Q2Y值越接近1，说明模型可靠性越强，反之，模型越不可靠。

1.5.3 生物标志物筛选、数学模型建立及验证

本研究借助机器学习中的随机森林（random forest，RF）算法建立水中尸体的PMSI 推断回归模型及死因判别的分类器模型。如1.2 节所述，将各时间点样本按照8∶2 的比例随机分为训练集及测试集。将训练集数据导入R v3.6.1，设训练集样本中各种代谢物的定量结果为自变量（x），分别以各样本的PMSI及死因为因变量（y）构建PMSI 推断回归模型及死因判别的分类器模型。为提高模型的应用性，减少自变量的数目，本研究以全部代谢物构建的回归模型误差为参考，对RF 模型进行五重十折交叉检验，以Inc-NodePurity 指标（该值越大，代表变量在该衡量标准下相对更加重要[23]）评估各代谢物在PMSI 推断回归模型中的重要性，筛选并确定与模型相关性高、贡献度大的生物标志物，并以此建立简化数学模型。

将测试集样本数据导入R v3.6.1并代入上述模型中，预测每个样本的PMSI及死因，并与实际值比较以验证模型的准确性及可靠性。以平均绝对误差（mean absolute error，MAE）为指标评价回归模型预测PMSI与实际值间的误差。以受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线的曲线下面积（area under the curve，AUC）及正确率为指标衡量分类器模型的预测精度。其中AUC 值越接近于1 的分类器模型，表明其预测正确率越高。AUC 的判断标准：0.50～0.70表示模型效果低，0.70～0.85 表示模型效果一般，0.85～0.95表示效果很好，0.95～1.00表示效果非常好。

2 结果

2.1 水中淹没早期大鼠玻璃体液代谢谱PCA 分析

通过QC、数据过滤及归一化等数据预处理步骤，最终得到991 种代谢物，这些代谢物包括氨基酸、糖、有机酸及脂类物质等。通过无监督的PCA 观察不同PMSI 及不同死因尸体玻璃体液样本的聚类特征，结果（图1）显示，QC 样本紧密聚集，表明该实验稳定性好。不同PMSI 样本在主成分2 轴上由下至上依次分布，特别是0 h 组与其他时间组明显分离，说明不同PMSI 的代谢谱不同，但12、18、24 h 组间明显重叠。此外，溺死组及死后即刻入水组样本无法通过PCA进行有效区分。

图1 训练集样本PCA 得分图Fig.1 PCA score plot of samples in the training set

2.2 水中淹没早期大鼠玻璃体液代谢物与死因之间的关系

采用PLS-DA 探索水中尸体2 种死因间玻璃体液代谢谱的差异。2 种死因间在PLS-DA 图上有较大范围重叠，且模型不可靠（Q2Y=0.585）（图2A），置换检验结果表明其未过拟合（图2B）。进而借助RF 算法建立分类器模型，并在测试集样本中进行验证，AUC为0.63，正确率为50%（图2C～D）。

图2 溺死组及死后即刻入水组大鼠尸体玻璃体液代谢谱的差异比较Fig.2 Comparison of vitreous humor metabolic profile differences between drowning and postmortem immediately submersion rats cadavers

2.3 水中淹没早期大鼠玻璃体液代谢谱与PMSI 之间的关系

PCA 分析结果显示，淹没早期的水中大鼠玻璃体液代谢谱具有一定的时间依从性。2 种死因间玻璃体液代谢谱差异较小，将不同死因组样本一并分析，应用有监督的PLS回归方法探索水中尸体玻璃体液代谢谱的时间变化规律。在PLS 回归得分图（图3A）中，不同PMSI 在主成分1 轴方向上由左至右依次分布，模型的置换检验结果证明其未过拟合（200次，图3B），表明水中淹没早期大鼠的玻璃体液代谢谱变化具有良好的时间规律性。

图3 水中尸体玻璃体液代谢谱变化规律Fig.3 Changing pattern of vitreous fluid metabolic profile of cadavers in water

基于代谢谱变化规律，借助RF 算法，构建了PMSI 推断模型（以下称为“全代谢物回归模型”），并应用测试集样本进行验证。RF 回归模型对测试集样本的PMSI 预测值与实际值比较，MAE 为0.827 h（图3C、表2）。

表2 全代谢物回归模型及简化回归模型对测试集样本的预测结果Tab.2 Full regression model and simplified regression model prediction results of metabolites for the samples in the test set （h）

2.4 推断水中淹没早期大鼠PMSI 生物标志物筛选与模型建立

对全代谢物回归模型进行五重十折交叉检验，结果表明，模型的预测误差随模型中变量（代谢物）数的增加呈现先下降后逐渐升高的趋势（图3D）。

以全代谢物回归模型误差为参考，尽量减少模型中指标的数量，结合模型建立过程中得到的Inc-NodePurity 指标评估各代谢物的重要性，最终筛选出13 种生物标志物（表3），其中7-甲基黄嘌呤及N2，N2-二甲基鸟苷重要性明显高于其他生物标志物。

表3 筛选出的13 种生物标志物信息Tab.3 Information of 13 biomarkers selected

筛选出的生物标志物的热力图（图4）显示，仅死后即刻入水组中18 h 的个别样本的代谢物含量与组内其他样本有较大差异外，13 种生物标志物含量均呈现较好的PMSI 依赖性变化趋势。基于13 种代谢物的含量变化重新建立简化回归模型并应用测试集样本进行验证，简化回归模型MAE为0.847 h（图5、表2），该简化模型预测结果与全代谢物回归模型的结果之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

图4 13 种生物标志物含量变化热力图Fig.4 Heat map demonstrating dynamic changes in 13 biomarkers

图5 简化回归模型对测试集样本的预测结果与实际结果比较Fig.5 Comparision between simplified regression model prediction results for the test set samples and actual results

3 讨论

自然界多种水体环境中均可能发现人类尸体，如江河、海洋及水库等，常为自杀、意外落水、他杀后抛尸入水及自然灾害导致死亡[3]。水中尸体PMSI 推断及死因判别对相关案件的侦破具有重要意义，但现有PMSI 推断方法的准确性有待提高。LC-MS/MS 技术将色谱高分离性能与质谱高灵敏度、高选择性及高通量的优点相结合，可同时检测死后机体内多种物质或指标的变化及差异[24]，为水中尸体的研究提供了有力工具。本研究基于LC-MS/MS 技术检测并分析25 ℃左右的淡水自然环境中水中早期大鼠玻璃体液中的代谢谱，初步探索了玻璃体液代谢组学在推断水中尸体早期PMSI 和死亡原因方面的应用。

本研究在所有样本中共检测到991 种代谢物，包括多类代谢物，构成了早期水中大鼠玻璃体液腐败过程中的代谢谱。HIRAKAWA 等[25]通过研究大鼠的肌肉代谢谱发现不同死因间代谢特征明显不同，并提出代谢组学可用于死因鉴别。但本研究通过PCA、PLS-DA 及分类器模型均未观察到溺死组及死后即刻入水组间的差异，说明通过玻璃体液代谢物尚不能有效鉴别水中尸体的死因，这可能与以下原因有关：（1）死亡过程产生的代谢物在不同组织中具有较大的差异；（2）外部或内部刺激引起机体某一组织或器官的代谢变化能够通过血液影响其他组织或器官的代谢谱，玻璃体液受血流的影响较小[26]。以上分析提示，玻璃体液代谢谱受死因影响小，也为适用于水中不同死因尸体的PMSI 推断研究提供了基础。研究[14,27]表明，玻璃体液中代谢物变化比血液更加缓慢、平稳，且其代谢物浓度与PMI 之间的相关性更强。本研究通过PCA 及PLS 回归分析均可观察到玻璃体液代谢谱在死后24 h 内连续变化，说明在淡水自然水体环境中玻璃体液代谢谱变化具有较好的时间规律性。死后机体的腐败涉及各种代谢物，其变化和PMI 间的相关性非常复杂，无法简化地通过单一指标的线性回归来解释[28]。相较于传统统计分析方法，RF 算法等人工智能机器学习算法可学习变量之间的复杂关系并建立数学模型，从而实现更准确的预测，更适于高维数据的处理与分析[29]。本研究基于代谢物集群的含量变化应用RF 算法建立回归模型用于水中尸体PMSI 推断，表明了玻璃体液中的代谢物能够较准确地推断水中尸体早期PMSI。

尽管本研究基于全部的代谢物构建了能够用于推断水中尸体PMSI 的模型，但研究[28]表明，死后多种代谢物的含量变化并非全部都与PMI 具有相关性，而且本研究的全代谢物回归模型的交叉检验结果也表明模型对PMSI 预测的准确性随着代谢物种类的增多先升高后下降。此外，为了提高该方法在水中尸体淹没时间推断中的可应用性，有必要对推断PMSI 具有重要作用的代谢物进行筛选并构建简化推断模型。因此，以全代谢物回归模型误差为标准，通过RF 算法筛选到13 种含量变化具有良好时间规律性且对模型贡献度较高的代谢物，并以此建立了准确预测PMSI的简化模型。既往采用玻璃体液中钾离子浓度变化推断PMI 所建立的线性回归方程[30]在24 h 内存在较大误差，而本研究中得到的PMSI 推断模型在24 h 内误差低。同时本研究观察到死后即刻入水组中1例经过18 h 浸泡后大鼠玻璃体液中目标代谢物含量与该亚组内其他样本具有较大差异，原因可能是实验对象个体间差异较大，但在该样本存在的情况下简化回归模型的预测准确性依旧较高，进一步说明了该模型的可靠性。需要注意的是，本项研究仍处于实验阶段，所得结果尚需在更大数据集及人体标本中通过靶向代谢组学方法检测目标代谢物含量变化，并借助机器学习算法构建数学模型进一步验证。

玻璃体液中代谢物含量的死后变化可能与周围眼组织的死后变化、毗连内眼结构的扩散、细菌的代谢活动甚至蒸发作用等密切相关[13,26]。近期应用玻璃体液进行代谢组学的研究[13-14,27,31]发现，次黄嘌呤、牛磺酸、胆碱、肌酸、甘油在内的多种代谢物与陆上不同种属动物的死后经过时间密切相关。本研究中筛选的代谢标志物仅甘油与上述研究中结果研究一致，可能与以下原因有关：（1）死后尸体保存条件不同，陆地上环境和淡水特殊环境的差异；（2）样本种属的差异；（3）土壤与水体中微生物组分和丰度具有较大的差异[32]，不同微生物对同种底物的降解速率及程度差异；（4）水体环境和陆地上尸体的蒸发程度差异。因此，陆地上尸体的相关研究成果并不能直接应用于水中尸体PMSI 推断，开展水中尸体的专项研究十分必要。

本研究应用代谢组学技术结合多元统计分析和RF 算法对水中尸体玻璃体液代谢谱进行研究，发现代谢物集群随水中尸体的淹没时间延长呈现时序性变化规律，筛选的13 种生物标志物建立的简化数学模型，有望用于水中尸体早期PMSI 的推断。