樟树叶纯露挥发性成分与抑菌活性研究

杨素华，曾宪彪，邓聿胤，陆顺忠，黎贵卿，苏骊华，党中广

（1.广西壮族自治区林业科学研究院/广西特色经济林培育与利用重点实验室，广西 南宁 530002；2.广西壮族自治区中医药研究院，广西 南宁 530022）

【研究意义】精油一般是指采用水蒸气蒸馏从天然植物的枝、叶、根、干、果等部位提取出来的芳香挥发油，具有抗菌活性，可以抑制细菌或者真菌的生长，已被广泛应用于食品加工、医疗保健、化妆品及农药研发等方面［1-3］。纯露是指水蒸气蒸馏提取芳香植物精油过程中，水蒸气冷凝下来的的副产品，含有少量的精油成分及活性物质，具有良好的抗菌、驱虫、保健作用［4］。探讨芳樟醇型、柠檬醛型、油樟型、龙脑型樟树叶纯露的挥发性成分、物理性质和抑菌效果，为樟树叶纯露作为天然防腐剂和消毒产品等提供参考。【前人研究进展】前人研究发现蒲公英、生姜、薄荷、艾叶、内蒙古薰衣草、香叶天竺葵等植物纯露具有抑菌性和抗氧化性［5-13］。王斌等［14］研究发现迷迭香纯露、薄荷纯露和玫瑰纯露对鲜切芋头具有很好的保鲜作用。张洪广等［15］研究发现玫瑰纯露具有保湿、美白、抗氧化等功效，可以开发成化妆水、消毒剂、果蔬保鲜剂等。樟树是主要的天然芳香植物树种，按樟树叶精油的主要成分，可将樟树叶精油分为芳樟型、油樟型、龙脑型、柠檬醛型等不同化学类型［16-21］。目前对樟树的研究，主要集中在精油的抗氧化性和抑菌性。李嘉欣等［22］研究发现异樟、脑樟、油樟和芳樟叶精油均具有一定的抗氧化能力。张平等［23］采用二倍释法测定油樟油对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果时，发现油樟油中具有抑菌活性的主要物质为松油烯-4-醇和1，8-桉叶油素。王芳等［24］采用二氧化碳膨胀乙醇从香樟叶中提取精油，发现精油对真菌有较高的抑制活性。对樟树叶纯露的研究甚少。吴芳等［25］以不同季节宜宾油樟叶纯露为研究对象，通过抑菌圈、最低抑菌浓度和最低杀菌浓度，研究不同季节纯露对大肠埃希氏菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌的抑菌活性，发现油樟叶纯露中的主要组分为1，8-桉叶油素、α-松油醇和松油烯-4-醇，不同季节纯露对4 种供试微生物均有明显的抑菌效果，对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好。可见纯露作为精油生产副产物，具有一定的开发潜力。【本研究切入点】目前对樟树的研究主要集中在精油的抗氧化性和抑菌性，对樟树叶纯露的研究甚少。本研究通过采用水蒸气蒸馏法提取芳樟醇型、柠檬醛型、油樟型、龙脑型樟树叶纯露，探讨纯露的挥发性成分、物理性质和抑菌效果。【拟解决的关键问题】本研究以柠檬醛型、芳樟醇型、油樟型、龙脑型樟树叶纯露为试验材料，研究其主要成分、物理性质及其对几种常见食源性致病微生物的抗菌效果，以期为纯露的开发利用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

主要仪器：恒温细菌培养箱（HYQX-II）、恒温霉菌培养箱（MJ-300），上海跃进医疗器械有限公司；高压灭菌锅（SX-500），TOMY公司；高温干燥烤箱（BPG-9050AH），上海一恒科学仪器有限公司；恒温（30~38℃）水浴锅（HH-6），常州国华仪器有限公司；电热套（98-I-B），天津市泰斯特仪器有限公司；气相色谱仪（Agilent 7890A）、气相色谱-质谱联用仪（Agilent 7890B-5977A），安捷伦科技有限公司；0.2 μm薄膜筛滤过除菌器（MILLEX GP）、旋转蒸发仪（RE－52AA），上海亚荣生化仪器厂。

不同化学类型的新鲜樟树叶采自广西壮族自治区林业科学研究院海拔为85 ～255 m 的种质资源库，每种化学型选取3 株，于2021 年5 月在同一株樟树的东、南、西、北、中等不同部位采集鲜叶约1 500 g。样品用塑料袋密封，置于4℃冰箱低温保存，待测。

培养基：胰酪大豆蛋白胨液体培养基（批号201010）、胰酪大豆蛋白胨琼脂培养基（批号190815）、沙氏液体培养基（批号190326）、沙氏琼脂培养基（批号200927），购自北京陆桥技术有限公司。

对照品：阳性对照品包括抗细菌的复方新诺明（400 mg 磺胺甲恶唑、80 mg 甲氧苄胺嘧啶，上海新亚药业闵行有限公司），抗真菌的洗必泰（广州邦乐达生物科技有限公司）；阴性对照品为生理盐水（0.9%，上海方太医疗器械有限公司）；固体溶剂对照品：二甲亚砜、标准缓冲液（广东光华科技股份有限公司）。

供试菌株：金黄色葡萄球菌（Staphyloccus aureus）〔CMCC（B）26003〕，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63501〕，大肠埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B）44102〕，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）〔CMCC（B）10104〕，白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（B）98001〕，以上标准菌株均由广东环凯科技有限公司提供，供试菌株由冻干质控菌种转种所生，是本种源的5 代内后裔。

1.2 试验方法

1.2.1 纯露的提取 将采集到的新鲜叶子剪至1~2 cm，称取1 000 g 叶子和去离子水1 000 mL置于挥发油装置中，加沸石进行水蒸气蒸馏3.5 h，收集挥发油测定器中的下层液体即得饱和纯露。再取500 mL 饱和纯露和50 mL 石油醚混合摇匀，将混合液用分液漏斗分离，分离后将上层油状有机液放入250 mL 锥形瓶，下层水溶液置于分液漏斗，再加入50 mL 石油醚后再分离，反复操作2 次。将3 次收集的油状有机液体加入25 g 硫酸钠，脱水，取上层油状液体于200 mL 鸡心瓶，在真空为-0.06 MPa，温度为46~48℃、转速为60 r/min的旋转蒸发仪上旋蒸1 min，即得到纯露挥发油。

1.2.2 纯露的主要成分分析 升温程序：色谱柱HP-INNOWAX（30 m×0.32 mm，0.5 µm）。初始温度70℃，以1.5 ℃/min 升至100℃，然后以3℃/min升至135℃，保持30 min，然后再以5℃/min 升至200℃，最后以10℃/min 升至250℃，保持10 min。进样量0.2 µL，进样口温度250℃，分流比50∶1，流速1 mL/min。

质谱条件：电离方式E1，电离能量70 eV，离子源温度250℃，质量扫描范围30~450 amu。

1.2.3 纯露的物理性质测定 pH 值：将pH 计的电极、蒸馏水和标准缓冲液调至25℃，用蒸馏水冲洗电极，用标准缓冲液校正pH 计。称取纯露100 mL 加入烧杯，将pH 计电极插入试样，待读数稳定后记录读数。平均测定3 次。

相对密度：采用密度瓶法测定。

耐热：在40℃下保持24 h，恢复至室温，观察有无分层现象。

耐寒：在-8℃下保持24 h，恢复至室温，观察有无分层现象。

离心考验：在转速2 000 r/min 下旋转30 min，观察有无分层现象。

1.2.4 纯露的抑菌活性检测 培养基制备：取胰酪大豆蛋白胨液体培养基30 g、胰酪大豆蛋白胨琼脂培养基40 g、沙氏液体培养基50 g、沙氏琼脂培养基70 g，分别用蒸馏水配成1 L 溶液，高压灭菌，密封存放，备用。

菌悬液制备：取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿脓假单孢菌、枯草芽孢杆菌冻干质控菌种的新鲜培养物接种至胰酪大豆蛋白胨液体培养基，置于35℃培养24 h，转入无菌生理盐水，稀释，倒入胰酪大豆蛋白胨琼脂培养基，置于35℃培养24 h；取白色念珠菌冻干质控菌种的新鲜培养物接种至沙氏液体培养基，置于25℃培养48 h，转入无菌生理盐水，稀释，倒入沙氏琼脂培养基，置于25℃培养48 h；试验菌悬液细菌密度约为50~100 CFU/mL。

抑菌性试验：分别采用试管二倍稀释法和纸片法。

试管法：抗金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌，绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌试验：试验在超净工作台上进行，取待检纯露、阳性（复方新诺明）试验药液、阴性试验药液灭菌玻璃试管各5 支，每管加胰酪大豆蛋白胨液体培养基2 mL，待检纯露、阳性（复方新诺明）试验药液、阴性试验药液2 mL加至第l 管，混匀后取2 mL 加至第2 管，同法依次对倍稀释至第5 管，各管药液稀释度分别为2、4、8、16、32 倍。第5 管混匀后弃去2 mL。然后每管加入细菌密度约为50 ～100 CFU/mL 的试验菌（金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌，绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌）悬液0.1 mL。另取2 支试管做阳性、阴性对照。置35℃培养24 h。该培养管的待检药物浓度即为待检药物的最低抑菌浓度 （MIC）。取无菌生长或菌生长受抑制试管内的培养物0.1 mL注入平皿，加注不超过45℃的胰酪大豆蛋白胨琼脂培养基15~20 mL，待冷后倒置于35℃培养箱，倒置培养24 h，观察有无菌落生长，取琼脂培养基生长菌落不超过5 个者，与其相对应的培养管药物浓度，即为该待检药物的最低杀菌浓度（MBC）［28］。重复5 次。

抗白色念珠菌试验：再取待检纯露、阳性（复方新诺明）试验药液、阴性试验药液灭菌玻璃试管灭菌玻璃试管各5 支，每管沙氏液体培养基2 mL。取已配制和除菌处理过的待检纯露、阳性（洗必泰）试验药液、阴性试验药液）2 mL 加至第1 管，混匀后取2 mL 加至第2 管，同法依次对倍稀释至第5 管。第5 管混匀后弃去2 mL。然后每管加入细菌密度约为50~100 CFU/mL 的试验菌（白色念珠菌）悬液0.1 mL。另取2 支试管做阳性、阴性对照。置25℃培养48 h。每药作双样品测定，培养后观察有无菌生长，记录MIC 和MBC。每种药对同一个细菌，同样过程重复5 次。

纸片法：取厚滤纸，用直径6 mm 冲子打出圆形纸片若干，高压灭菌。每一纸片吸取挥发油、纯露、复方新诺明、洗必泰、生理盐水、二甲亚砜浸湿，备用。分别将药帖片贴片帖贴于涂有金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌，绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆蛋白胨琼脂培养基平皿内培养24 h；分别将药帖片贴片帖贴于涂有白色念珠菌的沙氏琼脂培养基平皿内培养48 h。培养后测量帖片周围抑菌圈直径。每个处理3 次重复。抑菌圈实验结果判定参照以下标准：抑菌圈直径>20 mm 为极度敏感，15~20 mm 为高度敏感，10~15 mm 时为中度敏感，7~9 mm 时为低度敏感，<7 mm为不敏感［26］。

2 结果与分析

2.1 不同化学类型樟树叶纯露的成分及其相对质量

将所测成分的色谱峰与NIST14质谱数据库进行比对检索，并按相对丰度、质荷比、匹配度等进行核对比较，对各色谱峰所对应的物质加以确认，并采用色谱峰面积归一化法，得出不同化学类型樟树叶纯露平均相对质量分数>1%的主成分。由表1可见，芳樟醇型纯露平均相对质量>1%的化合物有6种，分别为γ-松油烯、芳樟醇、樟脑、4-松油醇、α-松油醇、香芹酚，纯露的主要成分为芳樟醇，平均相对质量为74.03%；柠檬醛型纯露平均相对质量>1%的化合物有10种，分别为芳樟醇、龙脑、4-松油醇、α-松油醇、香茅醇、橙花醛、香叶醇、香叶醛、葎草烯、石竹烯氧化物，纯露的主要成分为橙花醛和香叶醛，平均相对质量分别为14.23%、29.26%；油樟型纯露平均相对质量>1%的化合物有6种，分别为柠檬烯、1，8-桉叶油素、芳樟醇、龙脑、4-松油醇、α-松油醇，纯露的主要成分为1，8-桉叶油素，平均相对质量为50.36%；龙脑型纯露平均相对质量>1%的化合物有5种，分别为柠檬烯、樟脑、龙脑、香芹酚、石竹烯，纯露的主要成分为龙脑，平均相对质量为82.27%。柠檬醛型纯露平均相对质量>1%的化合物数量最多。

表1 不同化学类型樟树叶纯露的成分及其相对质量Table 1 Components and relative mass of hydrosols from different types of Cinnamomum camphora leaves

2.2 不同化学类型樟树叶纯露的物理性质

由表2 可见，柠檬醛型、芳樟醇型、油樟型、龙脑型樟树叶纯露均为无色澄清液体，均具有各自的特征气味，pH 值均为弱酸性，相对密度均>1.0000。不同化学类型纯露的pH 值和相对密度相差不大，其中龙脑型纯露的pH 值和相对密度稍高于其他类型纯露。从耐热、耐寒、离心考验等指标来看，不同化学类型纯露的性质比较稳定，不会在温度反复变化或者转动的情况下发生改变或者加速老化。

表2 不同化学类型樟树叶纯露的物理性质 Table 2 Physical properties of hydrosol from different types of Cinnamomum camphora leaves

2.3 不同化学类型樟树叶纯露的抑菌活性

柠檬醛型、芳樟醇型、油樟型、龙脑型樟树叶纯露的抑菌圈直径见表3。参照抑菌圈实验结果判定标准进行评价后发现，在合适温度下，各菌株经合适时间培养，菌落或菌苔生长良好，菌落特征符合菌株菌落特征。阳性药帖片周围有明显抑菌圈，阴性药帖片周围无抑菌圈。不同化学类型纯露对以白色念珠菌为代表的真菌均有抑制作用，油樟型纯露还对枯草芽孢杆菌有抑制作用，其他化学类型对细菌没有抑制作用。其中柠檬醛型、芳樟醇型纯露对白色念珠菌的抑菌圈直径均>20 mm，属于极度敏感，抑菌圈直径均为25 mm，抗菌效果很好。油樟型纯露对枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的抑菌圈直径都为6 mm，属于不敏感。龙脑型纯露对白色念珠菌的抑菌圈直径为10 mm，属于中度敏感。

表3 不同化学类型樟树叶纯露的抑菌圈直径Table 3 Diameter of inhibition zone of hydrosols from different types of Cinnamomum camphora leaves (mm)

柠檬醛型、芳樟醇型、油樟型、龙脑型樟树叶纯露的MIC 和MBC 见表4。在合适温度下，各菌株经合适时间培养，有菌无药对照管混浊有菌生长，有药无菌对照管澄明无菌生长，阳性药管呈澄清透明，阴性药管有紊絮状混浊或豆腐渣样凝块。不同化学类型纯露中，芳樟醇型纯露的抑菌效果最好，对所有试验菌的MIC 为250 μL/mL。其次抑菌效果较好的为油樟型和柠檬醛型樟树叶纯露，其对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的MIC均为250 μL/mL，对大肠埃希菌、铜绿脓假单孢菌、枯草芽孢杆菌的MIC 均为500 μL/mL；油樟型樟树叶纯露的杀菌效果最好，其对供试细菌和真菌的MBC 为250 μL/mL。其次是芳樟醇型和龙脑型樟树叶纯露，其对枯草芽孢杆菌的MBC 为250 μL/mL，对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿脓假单孢菌、白色念珠菌的MBC 均为500 μL/mL。

表4 不同化学类型樟树叶纯露的MIC 和MBCTable 4 MIC and MBC of hydrosols from different types of Cinnamomum camphora leaves

3 讨论

研究表明，樟树叶挥发油主要含有1，8-桉叶油素、芳樟醇、松油醇、樟脑、龙脑和柠檬醛等［17-20,27］化学成分，具有一定的杀菌、消毒效果，是食品、香精香料和医药等行业的重要原料［21］。吴克刚等［28］研究发现芳樟醇具有较强的气相抗菌活性。王新伟等［29］研究发现柠檬醛对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。桉叶油素可用于配制牙膏、化妆品、口香糖、驱风膏［30］等。马英姿等［31］研究发现樟树精油具有较好的抑菌效果，冰片（富含龙脑）具有很强的抗菌作用。而樟树叶纯露是提取精油后的副产物，也具有少量精油成分及活性物质，且产量大，易获得，如今后可以在天然防腐保鲜、消杀产品等方面应用，将具有一定的潜在开发利用价值。

试管法抗菌试验药物直接接触菌株，在有效浓度下，药物活性成分即可以有足够量进入菌体，抑制或杀灭菌，纸片法抗菌试验有赖于药物扩散并在纸片周围形成有效药物浓度，才能形成明显抑菌圈，某些脂溶性成份在水溶性琼脂培养基中的扩散性不是很好，所以会有样品在试管法试验中表现为有抑菌活性而在纸片法试验中抑菌圈不明显，此可以解释油樟醛型纯露在试管法具有很好的抑菌和杀菌作用，而在纸片法试验中无明显的抑菌活性，可能是纯露的抗菌成分为脂溶性物质。

目前，对芳香植物纯露的应用，有少数学者研究。高雅博［32］通过原料筛选、配方设计、性能评价及配方优化的研究确定了洗手液的基础配方及工艺流程，研发了一款茶树纯露为特征成分的抑菌洗手液。于晓雪等［33］在蛋鸡饮用水中添加茶树纯露，对蛋黄颜色、哈氏单位、蛋壳颜色等鸡蛋品质指标进行检测和分析，研究添加茶树纯露对鸡蛋品质的影响，为茶树纯露用于改善鸡蛋品质提供了参考。朱云娜等［34］在探讨香茅纯露对蔬菜种子萌发和幼苗生长的影响时，利用香茅纯露对番茄、菜心种子萌发和幼苗生长均存在“低促高抑”效应，将香茅纯露应用在蔬菜生产中。

本研究仅讨论了樟树叶纯露的挥发性成分、理化性质和抑菌效果，研究仍不够深入和全面，如果要将樟树纯露产品化，今后还要进一步对纯露的抑菌机理进行研究和探讨，以及开展对皮肤黏膜刺激性和人体毒性相关的研究。

4 结论

芳樟醇型樟树叶纯露的主要挥发性成分为芳樟醇，相对质量为74.03%；柠檬醛型樟树叶纯露的主要挥发性成分为橙花醛和香叶醛，相对质量分别为14.23%、29.26%；油樟型樟树叶纯露的主要挥发性成分为1,8-桉叶油素，相对质量为50.36%；龙脑型樟树叶纯露的主要挥发性成分为龙脑，相对质量为82.27%；芳樟醇型樟叶纯露的抑菌效果最好，其对供试细菌和真菌的MIC 均为250 μL/mL，其次抑菌效果较好的为油樟型和柠檬醛型樟树叶纯露；油樟型樟树叶纯露的杀菌效果最好，其对供试细菌和真菌的MBC 为250 μL/mL，其次是龙脑型和芳樟醇型樟树叶纯露。

各种纯露具有各自的特征气味，都是弱酸性的，相对密度均>1.0000。不同化学类型纯露的pH值和相对密度相差不大，其中龙脑型纯露的pH值和相对密度稍高于其他类型纯露，各纯露的性质稳定。