WSSV和DIV1感染凡纳滨对虾对血淋巴凝固的影响

严栩蘅，廖栩峥，何建国，尹 斌，李朝政

(1.中山大学 海洋科学学院，珠海 519082; 2.中山大学 生命科学学院，广州 510275；3.南方海洋科学与工程广东省实验室(珠海)，珠海 519082；4.岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，茂名 525099)

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)，是我国及全球重要的水产养殖物种之一[1]。病害是制约我国对虾业健康可持续发展的主要瓶颈，其中以病毒性疾病危害最严重。白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)和十足类虹彩病毒1(decapod iridescent virus 1，DIV1)是引起对虾病毒性病害的病毒。WSSV主要感染起源于外胚层和中胚层的组织细胞，造成不同组织广泛的变性坏死[2]，其中以鳃、胃、头胸甲和附肢的表皮细胞最敏感。病虾患病初期常静卧水底，甲壳上有白斑，出现空肠；患病后期体色泛红，对外界反应迟钝，死亡率极高，发病后3～14 d内死亡率可达100%[3-8]。DIV1是近年来在我国新发现的一种DNA病毒，主要感染鳃、肝胰脏、周足以及肌肉的造血组织和血细胞，有报道称其还会感染来自外胚层的表皮和淋巴器官[9]。病虾通常表现出空肠，肝胰腺萎缩，体色变浅，软壳等症状，患病后期丧失游泳能力[9-11]。此外，DIV1感染的凡纳滨对虾有时会出现游泳足附近的甲壳发黑的症状[12]。

凝血系统是生物先天免疫的重要组成部分，通过形成稳定的凝块封闭伤口防止体液流失[13-14]，也可以与其它免疫反应协同参与宿主免疫[15-16]。凡纳滨对虾受到外来病原侵染时，钙依赖性谷氨酰胺转移酶(transglutaminase，TG)从血细胞中释放，与血淋巴中的凝固蛋白(clotting protein，CP)形成交联聚集体，避免外界微生物从伤口侵入[17-18]。目前在凡纳滨对虾中已鉴定出两种TG，分别为I型(LvTGI)和II型(LvTGII)[19-21]。

甲壳类TG除参与凝血功能外，还在参与宿主免疫中发挥着重要作用。已有研究显示，TG在中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)和凡纳滨对虾中参与了抗副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)[22]和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)[23]等细菌的免疫反应。本研究以凡纳滨对虾为研究对象，通过qPCR和RNA干扰等方法，探究对虾LvTGI、LvTGII等凝血系统相关基因在抗病毒免疫反应中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

凡纳滨对虾养殖于岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名基地，对虾规格为每尾5 g左右，实验前在盐度为2.5%的人工海水中暂养7 d以减少环境应激，每天投喂商品化的对虾饲料3次，每天换水1次。

1.2 方法

1.2.1 WSSV和DIV1人工感染

取WSSV 或DIV1感染后的病虾肌肉组织1 g置于匀浆器中，加入10 mL无菌PBS，匀浆后使用0.22 μm滤膜进行过滤，滤液即为病毒原液。根据绝对定量测定病毒浓度，使用无菌PBS稀释浓度后用于人工感染实验。经测定WSSV的感染浓度为3.62×103copies/μL，DIV1感染浓度为2.88×102copies/μL，实验中每尾虾注射50 μL病毒稀释液。

将实验用虾分为2个实验组和1个对照组，每组各90尾对虾，在养殖桶中暂养72 h后，转移至玻璃箱中进行WSSV和DIV1人工感染实验。采用肌肉注射感染方法，使用1 mL胰岛素注射器将稀释后的WSSV和DIV1 病毒液注入凡纳滨对虾第二腹肢肌肉内，对照组注入无菌PBS，每尾虾注射50 μL。注射感染病毒后每隔12 h采集对虾鳃和肝胰腺组织存放于RNAlater中，于-80°C保存，用于后续实验检测。

1.2.2 凝血现象观察

凡纳滨对虾感染病毒后，使用2 mL注射器每隔12 h采集1 mL对虾血淋巴(不添加ACD抗凝剂)，置于2 mL离心管中，于4 °C保存，用于拍照观察。

1.2.3 总RNA提取及cDNA合成

将保存于RNA later中的凡纳滨对虾各组织提取总RNA，所用相关器皿及试剂提前做相应处理去除RNase污染。称取0.5 g对虾鳃组织或肝胰腺组织放入液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，转入2 mL离心管中，使用RNeasy Mine 试剂盒(Qiagen，Germany)提取总RNA，提取方法如说明书所示。提取RNA经过Bioanalyzer 2100进行浓度与纯度测定，之后使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。使用SYBR PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒合成cDNA。

1.2.4 定量PCR(qPCR)

根据LvCP、LvTGI和LvTGII的mRNA序列设计针对上述基因的特异性qPCR引物，以EF-1α作为内参基因。qPCR反应体系：5 μL SYBR Mix，0.2 μL正向/反向特异性引物，3.6 μL RNase-free H2O，总体系为10 μL。反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，40个循环；95 ℃反应5 s，60 ℃反应1 min以获得熔解曲线；最后设定50 ℃降温30 s。每份样品进行3次重复，用Livak法(2-ΔΔCt)对结果进行分析计算mRNA相对表达量。引物序列见表1。

1.2.5 dsRNA合成

重新设计PCR引物扩增LvTGI和LvTGII后回收片段连接至pMD-19T载体上，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α菌株中，挑取单菌落进行菌落PCR验证，重组质粒送至公司进行测序，确认序列来自LvTGI和LvTGII后作为dsRNA第一链合成模板。设计含有T7序列的特异性引物，按照T7 RiboMAX Express RNAi System(promega)试剂盒说明书合成dsRNA。dsRNA引物序列同表1。

表1 本文所用引物信息

1.2.6 RNA干扰(RNAi)及死亡率统计

将实验用虾分为2个实验组和1个对照组，每组各100尾。前期在养殖桶中暂养72 h后，转移至玻璃箱中进行实验。每尾虾注射10 μg dsRNA用于干扰目的基因的表达。dsRNA注射后48 h，采集鳃组织用于提取总RNA。采用qPCR方法对LvTGI和LvTGII的表达量进行分析，验证RNAi的干扰效率。注射dsRNA 48 h后，采用同1.2.1的方法进行WSSV和DIV1人工感染。每隔4 h进行一次观察计数，统计7 d内的累积死亡率。检测样品制备方法见1.2.3，检测干扰效率的qPCR引物同表1。

1.2.7 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 WSSV和DIV1感染影响血淋巴凝固

感染病毒后，每隔12 h抽取对虾血淋巴，观察血淋巴的凝固情况。正常情况下，对虾血淋巴从体内抽出后，几分钟内就会从液体状转变成不可流动的胶体状。在WSSV及DIV1感染后12、24 h血淋巴均能凝固[图1(a)和(b)]，在WSSV及DIV1感染60 h后，对虾血淋巴不再凝固，保持可流动的液体状态[图1(e)和(f)]。DIV1对血淋巴凝固的影响强于WSSV，在感染36 h后血淋巴不再呈胶体状[图1(c)(d)(e)和(f)]，而WSSV在感染60 h后才出现不凝固的现象[图1(e)和(f)]。结果表明，两种病毒感染均会影响凡纳滨对虾血淋巴凝固。

(a)～(f)分别为感染WSSV和DIV1在12 h(a)、24 h(b)、36 h(c)、48 h(d)、60 h(e)和72 h(f)时观察血淋巴凝固的情况，最左侧为注射PBS的对照组。

2.2 凝血相关基因响应WSSV和DIV1表达

人工感染WSSV和DIV1后，采用qPCR方法检测凡纳滨对虾凝血系统相关基因LvCP、LvTGI和LvTGII分别在鳃组织和肝胰腺中的表达量。结果显示：在鳃组织中，LvCP与LvTGI的表达整体受到抑制。LvCP在WSSV感染12 h到60 h内的表达量显著下调[图2(a)]。LvTGI在两种病毒感染24 h后的表达量都显著下降[图2(b)]。LvTGII在WSSV感染后的表达量显著上调，在72 h时表达量最高，是对照组的17倍，而在DIV1感染24 h到48 h内显著下调[图2(c)]。在肝胰腺中，LvCP在WSSV感染后表达量显著上调，在DIV1感染后的表达趋势先上升后下降[图2(d)]。LvTGI在两种病毒感染24 h后的表达量均显著下调[图2(e)]。值得注意的是，LvTGII在肝胰腺中的表达情况与在鳃组织中相反，在WSSV感染12 h到48 h内的表达趋势下降，而在DIV1感染后表达量显著上调[图2(f)]。结果证实病毒感染会影响凡纳滨对虾凝血系统相关基因的表达，推测凡纳滨对虾TG是病毒与凝血系统相互作用的靶点。

(a)～(c)分别为LvCP、LvTGI、LvTGII在鳃组织中的表达情况；(d)～(f)分别为LvCP、LvTGI、LvTGII在肝胰腺中的表达情况。* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。

2.3 敲降凝血相关基因抑制血淋巴凝固且增加对虾对WSSV或DIV1的易感性

为了进一步探究凡纳滨对虾凝血相关基因TG是否参与抗病毒免疫反应，采用RNAi方法敲降LvTGI和LvTGII，48 h后人工注射WSSV或DIV1，统计累积死亡率情况。qPCR结果显示，RNA干扰后LvTGI和LvTGII的表达量都显著低于对照组，表明dsRNA能够有效地敲降LvTGI和LvTGII基因[图3(a)]。敲降LvTGI和LvTGII后的虾血呈明显的流动液体状[图3(b)]，进一步证实了LvTGI和LvTGII为凝血系统中的关键基因。对病毒感染后的累积死亡率进行统计分析，敲降LvTGI和LvTGII后的患病对虾累积死亡率显著高于其对照组，且敲降LvTGII比敲降LvTGI对病毒感染后死亡情况的影响程度更大[图3(c)(d)和(e)]。结果表明，敲降凝血相关基因(LvTGI和LvTGII)干扰了血淋巴凝固及增加了对虾对WSSV和DIV1的易感性。

(a)～(e)分别为注射dsRNA后，鳃组织中RNAi干扰效率检测(a)、敲降LvTGI和LvTGII 48 h后的凝血现象观察(b)、单独敲降LvTGI和LvTGII后对虾死亡情况(c)、敲降LvTGI和LvTGII后感染WSSV对虾累积死亡率(d)、敲降LvTGI和LvTGII后感染DIV1对虾累积死亡率(e)；* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。

3 讨论与结论

大部分无脊椎动物拥有开放式循环系统，血淋巴通过开放式循环系统在各个组织间流动，其在运输氧气、传递信号、修复损伤、抵御病原入侵等方面发挥至关重要的作用。血淋巴凝结通常指无脊椎动物中由多种蛋白参与的一类复杂生物学过程，其生物学效应为使得流动的血淋巴变成不能流动的胶冻状凝块。因为是开放式循环系统，无脊椎动物相比脊椎动物更加依赖血淋巴来维持体液稳态和抵御由体表创伤引起的病原入侵。本研究主要探讨了两种水产DNA病毒(WSSV和DIV1)感染对宿主(对虾)血淋巴凝结的影响，以及对虾凝血相关基因在抵御病毒感染过程中的作用。

3.1 WSSV和DIV1感染对虾抑制血淋巴凝结

对虾血淋巴可能是多种不同病原感染后的共同作用位点。我们发现凡纳滨对虾感染WSSV或DIV1后都会出现血淋巴凝固被抑制或不凝固的现象。已有研究报道，凡纳滨对虾感染桃拉综合征病毒(taura syndrome virus, TSV)后也会出现血淋巴凝固不良的现象[24]，哈维弧菌(Vibrioharveyi)感染或其细胞外产物同时会导致血淋巴不凝结的现象[25]。这些报道表明，血淋巴是凡纳滨对虾免疫反应的部位之一，在不同病原感染过程中可能发挥重要的作用，病原感染会不同程度地破坏或抑制血淋巴正常凝集功能。

3.2 凝血相关基因LvTGI、LvTGII及CP不同程度地响应两种病毒感染

病毒感染会导致血淋巴凝固异常，表明凝血相关基因的表达可能会受到病毒感染的影响，凝血系统与抗病毒免疫之间存在关联性。在WSSV和DIV1感染下，LvCP在鳃组织中的表达量被明显抑制，而在肝胰腺中的表达量呈现先上升后下降的现象。Yeh等[26]发现在斑节对虾CP在鳃组织中表达量较高，而在肝胰腺中表达量较低。综上结果推测，在病毒感染后不同组织的CP响应感染的程度不同。然而，当前我们仍不知道这种上调是否是主动应对感染以维持血淋巴的正常功能，以及下调是否是由病毒感染出现的被动行为(抑制表达)。LvTGI在两种病毒感染后，在鳃组织和肝胰腺组织均被显著抑制，因此，LvTGI可能是探究宿主基因响应这两种病毒感染是否是被动行为的重要候选基因。LvTGII在受到病毒刺激后，在不同部位均有表达量上调的情况出现，然而，LvTGII在面对不同病毒感染时的表达模式存在差异：WSSV刺激后，LvTGII在鳃组织中表达量显著上调，而在肝胰腺中的表达量则先下降，后上升；DIV1刺激后，LvTGII在鳃组织的表达中受到抑制，而在肝胰腺中则显著上调表达。已有研究显示，WSSV主要感染鳃组织与上皮细胞[27]，DIV1主要感染对虾血细胞与肝胰腺等[28]，推测病毒感染后LvTGII表达量变化可能与病毒侵染部位有关，具体机制有待深入研究。

3.3 LvTGI和LvTGII在血淋巴凝结以及宿主防御病毒侵染中发挥重要作用

LvTGI和LvTGII是凡纳滨对虾TG的两种亚型，为了验证TG的免疫作用，使用RNAi敲降LvTGI和LvTGII，并统计敲降后对虾感染病毒后的死亡率情况。抑制LvTGI和LvTGII表达均会出现血淋巴明显不凝固的现象，表明凡纳滨对虾LvTGI和LvTGII都是凝血系统的关键基因。在感染两种病毒后，敲降LvTGI和LvTGII的对虾都出现了累积死亡率上升的情况，且敲降LvTGII对死亡率的影响比敲降LvTGI更明显。已有报道表明TG在抗病免疫中起到了积极作用：Maningas等[29]发现在日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)中敲降TG会加速感染WSSV对虾的死亡。而Fagutao等[30]发现TG的沉默会导致两种抗菌肽(甲壳素和溶菌酶)的表达量显著下调，表明TG参与某些抗菌肽的表达调控。结果明确了凡纳滨对虾LvTGI和LvTGII均参与了抗病毒免疫反应。然而，在两种病毒感染下，LvTGI在不同组织中的表达量均受到抑制，关于LvTGI参与免疫反应的机制还需进一步研究。

病毒往往需要克服甚至破坏宿主抗病毒免疫来获得成功感染。WSSV和DIV1均能破坏对虾血淋巴凝集反应，且敲降凝血关键基因显著增加了对虾对病毒的易感性。因此，我们推测对虾血淋巴的凝固作用可能与宿主抗病毒免疫反应密切相关。本研究为进一步解析凝血系统参与宿主抗病毒免疫反应的机理奠定了基础。