姜黄素对前列腺癌PC-3细胞体外生长的影响

程继 高丹 付国 董青川

(陕西省人民医院泌尿外科， 陕西 西安 710068)

前列腺癌(Prostate cancer)是常见的恶性肿瘤，手术切除、放疗和化疗是目前常用的临床治疗手段[1-2]。但常规化疗药物和放射治疗引起的副作用，严重影响了患者术后的康复和生活质量[3-5]。研究前列腺癌的病理学进程，不断探寻其发病的分子机制，寻找新的治疗靶点和治疗手段，是目前临床急需解决的问题。姜黄素(Curcumin)是一种多酚类物质，提取于姜黄、郁金等姜科植物中[6]。国内外的研究均已证实[7-8]，姜黄素具有抗氧化、抗炎等作用，同时还有抑制肿瘤生长的效应。但姜黄素对前列腺癌生物学行为的影响，以及参与上述调控进程的相关信号通路分子，目前依然不完善，需要进一步的体内外研究来证实。Notch1分子与前列腺癌的增殖密切相关，可以通过其下游的PI3K-AKT-mTOR和MEK-ERK途径，分别影响肿瘤血管生成和体外生长的过程[9]。但是否姜黄素通过影响Notch1分子，调控前列腺癌的发生和发展过程，目前相关报道鲜少，仍有待进一步的研究。 本实验以人前列腺癌PC-3细胞为研究对象，通过给予不同浓度的姜黄素处理，观察前列腺癌细胞增殖和凋亡的变化，同时分析姜黄素对Notch1分子表达水平的影响，观察是否姜黄素影响前列腺癌PC-3细胞体外生长，进一步阐明姜黄素抑制前列腺癌生长的分子机制，为临床前列腺癌的化疗提供新的策略和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料和细胞培养 人前列腺癌PC-3细胞株购于美国ATCC公司。姜黄素(Curcumin)购于 Sigma公司。DMEM培养液和胎牛血清均购于Invitrogen公司。人前列腺癌PC-3细胞，参考文献常规培养，37℃孵箱，95%O2和5%CO2，DMEM培养液包括10%灭活血清。

1.2 对细胞增殖的影响 常规培养人前列腺癌PC-3细胞，接种于96孔培养板，密度为5×103/孔，给予不同浓度的姜黄素处理(溶于DMSO)，分别为500 nmol/L组、10 μmol/L组、100 μmol/L组和空白对照组(给予DMSO处理)。收集细胞，通过MTT法观察姜黄素对PC-3细胞增殖的影响。PCNA mRNA可反应肿瘤细胞增殖水平，收集上述细胞，提取RNA，通过定量PCR法检测PCNA mRNA水平的变化，观察不同浓度姜黄素对PC-3细胞中PCNA mRNA的影响，分析各组间差异。

1.3 细胞凋亡的变化 收集不同处理组的细胞，与Annexin V/PI溶液室温孵育30 min，通过流式细胞仪检测不同处理组PC-3细胞凋亡率的变化，观察不同浓度姜黄素处理3 d后，对PC-3细胞凋亡率的影响。Bcl-2分子mRNA水平可反应肿瘤细胞凋亡状态，收集上述细胞，提取RNA，通过定量PCR法，检测Bcl-2 mRNA水平的变化，观察不同浓度姜黄素对PC-3细胞中Bcl-2 mRNA水平的影响，分析各组间差异。

1.4 Caspase活性检测 收集不同处理组的细胞，按Caspase活性检测试剂盒操作规范要求，处理细胞，离心20 min，2000转/min，上清孵育60 min，测定各组样品吸光度的变化，分析PC-3细胞中Caspase-3和Caspase-9活性的变化，观察不同浓度姜黄素处理3 d后，对PC-3细胞中Caspase活性的影响。

1.5 分析Notch1和PI3K的变化 PC-3细胞经不同浓度姜黄素处理3 d后，收集上述经过姜黄素处理的细胞，提取RNA，通过定量PCR法，检测PC-3细胞中Notch1和PI3K mRNA水平变化，分析各组间差异；同时，PC-3细胞经不同浓度姜黄素处理3 d后，收集上述各组细胞，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，通过蛋白质电泳检测PC-3细胞中Notch1和PI3K蛋白表达的变化。

2 结果

2.1 姜黄素对PC-3细胞增殖的影响 500 nmol/L组、10 μmol/L组和100 μmol/L组其存活率均显著低于空白对照组(P<0.05)；而与500 nmol/L组比较，10 μmol/L组和100 μmol/L组对PC-3细胞增殖的影响差异有统计学意义(P<0.05)，提示姜黄素影响PC-3细胞增殖的效应具有一定的剂量依赖性。实验结果还发现，姜黄素抑制PC-3细胞增殖的效应具有一定时间依赖性，PC-3细胞经低剂量姜黄素处理3 d后，细胞增殖水平受到显著抑制。500 nmol/L组其PCNA mRNA水平降低，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。10 μmol/L组和100 μmol/L组中PCNA mRNA水平显著低于500 nmol/L组(P<0.05)，提示姜黄素降低PCNA mRNA水平，抑制PC-3细胞增殖，并体现一定的剂量依赖性。见表1、图1。

表1 姜黄素对前列腺癌PC-3细胞存活率的影响Table 1 Effect of Curcumin on PC-3 cell proliferation

2.2 姜黄素对PC-3细胞凋亡率的影响 500 nmol/L组凋亡率高于空白对照组(P<0.05)；与500 nmol/L组比较，10 μmol/L组、100 μmol/L组对PC-3细胞凋亡率的影响差异有统计学意义(P<0.05)，提示姜黄素影响PC-3细胞凋亡率的效应具有一定的剂量依赖性。PC-3细胞中Bcl-2 mRNA水平较高，500 nmol/L组Bcl-2 mRNA水平降低，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。10 μmol/L组和100 μmol/L组细胞中Bcl-2 mRNA水平显著低于500 nmol/L组(P<0.05)，提示姜黄素降低Bcl-2 mRNA水平，诱导PC-3细胞凋亡，并体现一定的剂量依赖性。见表2、图2。

表2 姜黄素对PC-3细胞凋亡率的影响Table 2 Effect of Curcumin on PC-3 cell apoptosis

2.3 姜黄素对PC-3细胞中Caspase活性的影响 500 nmol/L组Caspase-3和Caspase-9活性高于空白对照组(P<0.05)。同时，姜黄素对Caspase-3和Caspase-9活性的影响，也体现一定的剂量依赖性，10 μmol/L组和100 μmol/L组PC-3细胞中Caspase-3和Caspase-9活性显著高于500 nmol/L组(P<0.05)。见图3、图4。

2.4 姜黄素对PC-3细胞中Notch1水平的影响 PI3K-AkT-mTOR是Nototh1分子下游信号途径，Notch1通过上述途径调控肿瘤细胞的体外生长状态。500 nmol/L组Notch1和PI3K 蛋白表达降低，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。10 μmol/L组和100 μmol/L组PC-3细胞中Notch1和PI3K蛋白表达显著低于500 nmol/L组(P<0.05)，提示姜黄素可抑制Notch1和PI3K蛋白表达，并体现一定的剂量依赖性。PC-3细胞中Notch1和PI3K mRNA水平较高，500 nmol/L组Notch1和PI3K mRNA水平降低，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。10 μmol/L组和100 μmol/L组PC-3细胞中Notch1和PI3K mRNA水平显著低于500 nmol/L组(P<0.05)，提示姜黄素可抑制Notch1 和PI3K mRNA的水平，并体现一定的剂量依赖性；此外，姜黄素通过Notch1途径调控PI3K mRNA水平，影响PC-3细胞体外生长。见图5、图6、图7。

3 讨论

姜黄素作为一种传统的植物药物，已在中国和印度有超过2000年的应用历史。在多种慢性疾病的治疗中，姜黄素已被证实具有重要的药理效应，包括炎症，风湿，代谢紊乱，肝脏疾病，肥胖，神经退行性疾病和一些恶性肿瘤[10-12]。截止2018年，在国内外已发表的姜黄素有关的研究论文中(来源于pubmed检索)，37% 的文章都是与肿瘤相关的研究[13]。肿瘤是目前发达国家位居第一位的死亡因素，尽管近年来早期诊断和多种治疗措施的应用，有效降低了肿瘤引起的死亡率，但肿瘤耐药性等因素依然是目前面临的巨大难题，严重影响了临床的治疗效果。研究已发现，姜黄素自身具有一定的抗肿瘤效应，同时联合应用姜黄素，还可以显著提高其他抗肿瘤手段的临床治疗效果，通过影响不同的信号通路，增加放疗敏感性或化疗敏感性[14-16]。体内外实验表明[17]，姜黄素可以显著抑制肝癌细胞的增殖，影响细胞周期和细胞凋亡。此外，研究[18]还发现，姜黄素能够影响血管的生成，从而可以调控肿瘤血管生成的过程。据报道，姜黄素可调控p53、NF-kB、MAPK、Nrf2等信号通路，影响结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、口腔癌等恶性肿瘤的病理进程。姜黄素可以显著降低IkB 激酶的磷酸化水平，阻止NF-kB亚单位p65的核转录作用，减少IL-6和IL-11等细胞因子的分泌，抑制NF-kB活性，影响肿瘤细胞的凋亡，增殖等过程。前列腺癌是常见的恶性肿瘤，研究前列腺癌的分子机制，寻找新的治疗靶点和治疗手段，提高临床疗效，减轻常规化疗药物和放射治疗引起的副作用，对于改善患者生存质量，具有重要的临床意义。

研究[19-20]证实，在肿瘤的发生和发展过程中，Notch信号通路参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡等过程，相关的分子在上述通路中扮演着重要的作用。Notch受体是以异源二聚体形式存在的膜蛋白分子[21]。研究[22]还发现，Notch1分子在肿瘤细胞中表达增高，针对肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡等，Notch分子均参与调控上述过程。在淋巴瘤的发展进程中，Myc可以与Notch1相互协同，促进肿瘤细胞的体外增殖，这一过程与MAML突变有关。此外，PI3K-AKT-mTOR 和MEK-ERK途径与Notch1分子的表达水平密切相关，影响肿瘤的生长。PI3K-AKT-mTOR是Notch1分子下游信号途径，Notch1通过上述途径调控肿瘤细胞的体外生长状态。因此，寻找与Notch1分子作用相关的多酚类物质，有望影响肿瘤细胞的体外增殖等过程，具有一定的临床意义。但是否姜黄素可以影响前列腺癌细胞中Notch1分子的水平，调控前列腺癌的发生和发展过程，目前尚未见相关报道，其分子机制有待进一步阐明。

本研究结果发现，不同剂量的姜黄素可以抑制PC-3细胞的增殖，并具有一定的剂量依赖性。此外，姜黄素可以诱导PC-3细胞凋亡的发生，显著增加PC-3细胞凋亡率，这一效应可能与Caspase活性有关。经过姜黄素处理的PC-3细胞，其Caspase-3和Caspase-9活性显著增加。我们的结果还证实，PC-3细胞中Notch1 和PI3K mRNA高表达。PC-3细胞中Notch1和PI3K mRNA水平较高，经过姜黄素处理的PC-3细胞，可显著降低Notch1 和PI3K mRNA水平和蛋白表达，体现一定的剂量依赖性。提示，姜黄素可能通过对Notch1分子的抑制效应，调控PI3K水平，影响前列腺癌细胞的体外生物学特点，但具体的分子机制仍需要进一步的研究来证实。

4 结论

本研究结果表明，姜黄素可以影响前列腺癌细胞增殖、凋亡等过程，可能为临床前列腺癌的化疗提供新的策略和实验依据。