lncRNA PITPNA-AS1靶向miR-367-3p调控多发性骨髓瘤细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制

饶琦 王丹丹 罗婷 赵佳莉 赵寅

(四川大学华西医院血液科·四川大学华西护理学院，四川 成都 610041)

多发性骨髓瘤是起源于B细胞的一种致命性肿瘤，约占所有血液恶性肿瘤的10%[1]。随着治疗方案的改进和自体干细胞移植清髓化疗的使用，多发性骨髓瘤患者的治疗取得巨大进步，但其在很大程度上仍无法治愈[2]，并且多发性骨髓瘤的发病机制仍有待阐明。长链非编码RNA (Long noncoding RNA，lncRNA)PITPNA反义RNA 1(PITPNA antisense RNA 1，PITPNA-AS1)是一种新发现的lncRNA，在乳头状甲状腺癌[3]、非小细胞肺癌[4]和结直肠癌[5]中高表达，通过海绵不同的微小RNA (MicroRNA，miRNA)起着致癌因子的作用加速肿瘤进展。但lncRNA PITPNA-AS1在多发性骨髓瘤中的功能有待探索。最近的证据表明，miRNA参与多发性骨髓瘤的发展[6]。miR-367-3p作为抑癌因子，涉及多种肿瘤的病理过程，例如宫颈癌组织和细胞系中miR-367-3p低表达，miR-367-3p过表达抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭[7]。上调的miR-367-3p使肺癌的增殖和迁移能力减弱[8]。但是，miR-367-3p是否调节多发性骨髓瘤的生长和转移仍是未知的。因此，本研究探讨lncRNA PITPNA-AS1在多发性骨髓瘤中的表达情况及其对多发性骨髓瘤对细胞增殖、迁移和侵袭行为的影响，分析其潜在机制，以期为多发性骨髓瘤的分子疗法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226、MM1. S、OPM-2(美国型培养物保藏中心)；小鼠成骨细胞系MC3T3-E1(无锡欣润)；siRNA-lncRNA PITPNA-AS1(si-lncRNA PITPNA-AS1)、siRNA NC (si-NC)、pcDNA、pcDNA-lncRNA PITPNA-AS1、miR-367-3p mimics、miR-367-3p inhibitors (anti-miR-367-3p)、mimics/inhibitors NC (miR-NC/anti-miR-NC)(上海GenePharma)；细胞计数试剂盒8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)、双荧光素酶试剂盒(上海Yeasen)；蛋白质提取试剂盒(北京Solarbio)；基质金属蛋白酶(Matrix metalloprotease，MMP)2兔多克隆抗体、MMP9兔多克隆抗体、二抗(美国Abcam)；萤光素酶报告载体pGL3、AMV反转录酶试剂盒(美国Promega)；SYBR Green Real Time PCR Master Mix试剂盒(德国Roche)。

1.2 细胞培养 将RPMI-8226、MM1. S、OPM-2、MC3T3-E1细胞保存在Roswell Park Memorial Institute 1640培养基(RPMI1640)中，并混合有10%胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素。MC3T3-E1细胞用混合有10% FBS的α-MEM培养基。所有细胞均在5% CO2、湿润培养箱中于37℃孵育。

1.3 定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR) TRIzol试剂用于从成骨细胞MC3T3-E1、多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226、MM1. S、OPM-2中提取RNA。采用AMV反转录酶试剂盒将2 μg总RNA反转录成cDNA，然后使用SYBR Green Real Time PCR Master Mix试剂盒在ABI 7900 Real-Time PCR中进行qRT-PCR。以GAPDH和U6为内参，通过2-ΔΔCt方法估算lncRNA PITPNA-AS1和miR-367-3p表达。引物序列：GAPDH 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′(Forward)，5′-AGGGGCCATC CACAGTCTTC-3′(Reverse)；U6 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(Forward)，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(Reverse)；lncRNA PITPNA-AS1 5′-GCAGGGTGGATAAAGAGGA-3′(Forward)，5′-CCTACTGACAGGATGTCCT-3′(Reverse)；miR-367-3p 5′-GCAGAATTGCACTTTAGCAATG-3′(Forward)，5′-GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCAC-3′(Reverse)。

1.4 细胞转染与分组 将多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226以1×105细胞/孔接种到6孔板，培养至70%～80%纯度，使用Lipofectamine 2000，在RPMI-8226细胞中转染si-NC (si-NC组)、si-lncRNA PITPNA-AS1(si-lncRNA PITPNA-AS1组)、miR-NC (miR-NC组)、miR-367-3p mimics (miR-367-3p组)，或同时转染anti-miR-NC与si-lncRNA PITPNA-AS1(anti-miR-NC+si-lncRNA PITPNA-AS1组)、anti-miR-367-3p与si-lncRNA PITPNA-AS1(anti-miR-367-3p+si-lncRNA PITPNA-AS1组)，并将未转染的细胞设为对照组(NC组)。48 h后利用qRT-PCR检测RPMI-8226细胞的转染情况，并进行后续测定。

1.5 Western Blot 使用蛋白质提取试剂盒对RPMI-8226细胞进行蛋白质分离。将30 μg蛋白质样品上样到12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜在脱脂奶中封闭，然后与抗MMP2(1：2 000稀释度)、MMP9(1：2 000稀释度)的特异性一抗一起孵育，然后在辣根过氧化物酶偶联的二抗(1：5 000稀释)中进行探测。使用化学发光试剂对蛋白条带进行可视化和分析。

1.6 CCK-8实验 将RPMI-8226细胞以5×103/孔接种在96孔板中，48 h后引入10 μL CCK-8试剂，将细胞在37℃下再保持1 h。使用Biotech酶标仪记录每个孔在450 nm处的吸光度A值，细胞活力与A值成正比。

1.7 细胞克隆形成实验 将RPMI-8226细胞以300细胞/孔接种在6孔板中。常规培养2周后，将克隆的细胞(>50细胞)用甲醇固定，并用0.1%结晶紫染色，然后在显微镜下计数。

1.8 Transwell实验 RPMI-8226细胞的侵袭和迁移能力通过Transwell测定法进行评估。为了检测侵袭能力，将无血清培养基中的4×104个RPMI-8226细胞接种到涂有Matrigel的上室中。为了进行迁移能力检测，将无血清培养基中的1×104细胞接种到上室中。Transwell下室填充10% FBS的培养基。孵育后24 h，将迁移或侵袭性细胞用0.1%的结晶紫染色，并在光学显微镜下计数。

1.9 双荧光素酶活性检测 用starbase预测lncRNA PITPNA-AS1和miR-367-3p的结合区域。将相应的含有miR-367-3p结合位点的lncRNA PITPNA-AS1-野生型(WT)及突变型(MUT)序列插入萤光素酶报告载体pGL3，以构建lncRNA PITPNA-AS1-WT及MUT报告基因载体。在多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226中同时转染miR-367-3p mimics或miR-NC和lncRNA PITPNA-AS1-WT及MUT报告基因载体。36 h后利用双荧光素酶试剂盒评估相对荧光素酶活性。另将pcDNA、pcDNA-lncRNA PITPNA-AS1、si-NC、si-lncRNA PITPNA-AS1转染到RPMI-8226细胞中，48 h通过qRT-PCR测定lncRNA PITPNA-AS1和miR-367-3p的表达情况。

2 结果

2.1 在多发性骨髓瘤细胞系中lncRNA PITPNA-AS1和miR-367-3p的表达情况 与成骨细胞MC3T3-E1比较，多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226、MM1. S、OPM-2中lncRNA PITPNA-AS1表达量均增加，miR-367-3p的表达量均减少(P<0.05)。将差异最显著的RPMI-8226细胞用作后续研究对象。见表1。

表1 在多发性骨髓瘤细胞系中，lncRNA PITPNA-AS1和miR-367-3p的表达情况

2.2 干扰lncRNA PITPNA-AS1抑制多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226增殖、迁移和侵袭 在多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226中转染si-lncRNA PITPNA-AS1来干扰lncRNA PITPNA-AS1，si-lncRNA PITPNA-AS1组较NC组减少lncRNA PITPNA-AS1、MMP2蛋白和MMP9蛋白的表达量，并降低细胞活力、克隆形式数、迁移和侵袭数量(均P<0.05)，而si-NC组较NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2、图1。

表2 干扰lncRNA PITPNA-AS1抑制多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226增殖、迁移和侵袭Table 2 Interfering with lncRNA PITPNA-AS1 inhibits the proliferation，migration and invasion of multiple myeloma cells RPMI-8226

2.3 miR-367-3p高表达抑制多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226增殖、迁移和侵袭 在多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226中转染miR-367-3p mimics，miR-367-3p组miR-367-3p表达量比miR-NC组高，MMP2蛋白、MMP9蛋白的表达量、细胞活力、克隆形式数、迁移和侵袭数量均比miR-NC组低(均P<0.05)，见表3、图2。

表3 miR-367-3p高表达抑制多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226增殖、迁移和侵袭Table 3 High expression of miR-367-3p inhibits the proliferation，migration and invasion of multiple myeloma cells RPMI-8226

2.4 lncRNA PITPNA-AS1靶向调控miR-367-3p的表达 在starbase中预测miR-367-3p和lncRNA PITPNA-AS1的靶向结合(见图3)。miR-367-3p组lncRNA PITPNA-AS1-WT相对荧光素酶活性比miR-NC组减少了0.53倍(P<0.05)，但miR-367-3p组与miR-NC组lncRNA PITPNA-AS1-MUT相对荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)(见表4)。pcDNA-lncRNA PITPNA-AS1组多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226中lncRNA PITPNA-AS1表达量比pcDNA组高，miR-367-3p表达量比pcDNA组低(均P<0.05)；si-lncRNA PITPNA-AS1组lncRNA PITPNA-AS1表达量比si-NC组低，miR-367-3p表达量比si-NC组高(均P<0.05)，见表5。

表4 miR-NC或miR-367-3p mimics与lncRNA PITPNA-AS1-野生型(WT)及突变型(MUT)报告质粒共转染多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226后双荧光素酶活性检测

表5 qRT-PCR检测miR-367-3p的表达Table 5 The expression of miR-367-3p detected by qRT-PCR

2.5 anti-miR-367-3p可以逆转si-lncRNA PITPNA-AS1对多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226增殖、迁移和侵袭的影响 在多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226细胞中同时转染anti-miR-367-3p和si-lncRNA PITPNA-AS，anti-miR-367-3p+si-lncRNA PITPNA-AS组miR-367-3p表达量低于anti-miR-NC+si-lncRNA

PITPNA-AS1组，MMP2蛋白、MMP9蛋白的表达量、细胞活力、克隆形式数、迁移和侵袭数量均高于anti-miR-NC+si-lncRNA PITPNA-AS1组(均P<0.05)，见图4、表6。

表6 Anti-miR-367-3p可以逆转si-lncRNA PITPNA-AS1对多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226增殖、迁移和侵袭的影响

3 讨论

越来越多的证据表明，lncRNA分子的表达与许多肿瘤的发展和进展有关，lncRNA介导的生物学是癌症进展的重要关键途径[9-11]。由于lncRNA参与增殖、凋亡、代谢和分化，它们在包括多发性骨髓瘤在内的许多疾病的生物学过程和发病机理中起着关键作用[12]。lncRNA PITPNA-AS1定位于染色体17p13.3，显示出对肿瘤生长的促进作用。Sun等[13]在肝细胞癌组织中观察到lncRNA PITPNA-AS1升高，其在体外通过靶向miR-876-5p具有促进肝细胞癌的生长和转移的致癌作用。Guo等[14]发现人宫颈癌组织和细胞系中lncRNA PITPNA-AS1显著增加，其过表达促进宫颈癌细胞增殖，而lncRNA PITPNA-AS1敲除抑制细胞增殖，并且lncRNA PITPNA-AS1的调控作用与海绵miR-876-5p有关。另一项研究表明，lncRNA PITPNA-AS1在肺鳞癌样本中高度表达，其缺失阻碍了肺鳞癌细胞的增殖和迁移能力[17]。然而lncRNA PITPNA-AS1在多发性骨髓瘤中的作用仍然未知。与前述研究相类似，本研究发现干扰lncRNA PITPNA-AS1可抑制骨髓瘤细胞RPMI-8226的增殖、迁移和侵袭。因此，确定lncRNA PITPNA-AS1在多发性骨髓瘤中同样起到肿瘤促进剂的作用。

本研究还探讨了lncRNA PITPNA-AS1在多发性骨髓瘤中的潜在机制，双荧光素酶报告测定和qRT-PCR实验证实miR-367-3p是lncRNA PITPNA-AS1的靶标之一。一项研究[16]表明，miR-367-3p是化疗前、化疗中和化疗后转移性睾丸生殖细胞癌的血清生物标志物。miR-367-3p在胶质瘤组织和细胞系中下调，作为肿瘤抑制因子，阻碍胶质瘤细胞的恶性增殖、迁移和侵袭[17-18]。Raikundalia等[19]在乳腺癌MCF-7细胞中转染miR-367-3p，发现细胞表现出较高水平的凋亡和较低的细胞迁移。子宫内膜癌组织中的miR-367-3p显著下调，通过抑制HMGA2的表达来抑制子宫内膜癌细胞的恶性行为[20]。然而关于miR-367-3p在多发性骨髓瘤中的研究报道鲜少。本研究发现多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226、MM1. S、OPM-2中miR-367-3p的表达降低，还证实miR-367-3p高表达能抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖和转移，表明miR-367-3p是多发性骨髓瘤的抑癌基因。lncRNA通常作为miRNA海绵来调节各种癌症的进展[21-23]。如lncRNA PITPNA-AS1通过海绵miR-129-5p促进甲状腺乳头状癌细胞的增殖和迁移，抑制细胞凋亡[3]。lncRNA PITPNA-AS1沉默通过靶向miR-32-5p抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、转移和上皮间质转化[4]。lncRNA OIP5-AS1在胃癌细胞中作为miR-367-3p的内源性海绵发挥致癌作用[24]。本研究中，miR-367-3p被鉴定为lncRNA PITPNA-AS1的靶miRNA，lncRNA PITPNA-AS1直接负向调控miR-367-3p的表达。此外，干扰lncRNA PITPNA-AS1对多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226增殖、迁移和侵袭的抑制作用可被anti-miR-367-3p逆转。这表明lncRNA PITPNA-AS1通过在多发性骨髓瘤中海绵miR-367-3p来发挥其致癌作用。

4 结论

在多发性骨髓瘤细胞中lncRNA PITPNA-AS1水平上调，而lncRNA PITPNA-AS1通过调节miR-367-3p抑制多发性骨髓瘤细胞的生长和转移。lncRNA PITPNA-AS1/miR-367-3p调节网络为多发性骨髓瘤的发展提供了新视角，而lncRNA PITPNA-AS1可能是多发性骨髓瘤的关键治疗和诊断目标。