肠杆灵散及球虫血痢散对鸡肠道微生物菌群结构多样性影响比较试验研究

文正常， 吴玙彤 ， 王 璇， 潘淑惠， 吴 仙， 张杨子

（贵州省畜牧兽医研究所，贵州贵阳550005）

“球虫血痢散” 具有杀虫、止血、清热燥湿、涩肠止泻之功效， 主要用于禽小肠球虫或盲肠球与致病性大肠杆菌混合感染性疾病的生产防治；“肠杆灵散” 具有清热燥湿、泻火解毒、凉血止痢、健脾理气之功效， 主要用于禽原发或继发性大肠杆感染性疾病的生产防治。 药物体外抑制及防治试验研究表明（文正常等，2012a、2012b），“球虫血痢散”对禽致病性大肠杆菌、球虫孢子化卵囊增殖均有显著抑制作用， 对禽致病性大肠杆菌CVCC-245 株的抑菌直径为4.8 ~ 6.6 mm；“肠杆灵散”对禽致病性大肠杆菌CVCC-245 株的抑菌直径为4.2~ 6.5 mm，临床防治应用治愈率为92.3%。 为进一步探讨两个中草药组方药物使用对禽肠道菌群结构多样性及调整肠道内环境微生态菌群平衡的作用及影响， 并与禽肠道常用抗生素药物硫酸安普霉素进行比较， 本试验以贵州小香鸡为研究对象，开展7 d 连续药物饲喂试验，经鸡肠道内容物细菌总DNA 提取、PCR 扩增及Miseq 高通量宏基因组序列测定，分析微生物菌群厚壁菌门、变形杆菌门的Chao1、ACE 指数变化情况和种（species）水平相对丰度，对试验药物在鸡肠道菌群的自然组成结构影响进行整体评价。

1 材料与方法

1.1 试验动物及饲养管理 贵州省地方小香鸡3号24 只，雌雄各半，体重（1.5±0.5）kg/羽，购于修文县某肉鸡养殖场。 本试验在贵州省畜牧兽医研究所动物实验室进行。 按肉鸡常规饲养程序进行饲养管理，5 层阶梯式笼养，自由采食和喂水。

1.2 试验药物 “肠杆灵散”制剂药物组方主要为黄连、黄柏、钩藤、大黄、栀子、白头翁、苍术、厚朴、枳壳、秦皮；“球虫血痢散”中草药组为青蒿、常山、钩藤、黄柏、栀子、穿心莲、紫花地丁、陈皮、甘草，由贵州省畜牧兽医研究所提供，委托项目协作单位山东济南华神动物药业有限公司代加工生产。规格：1 kg/包，生产日期：2019 年10 月21 日，有效期2 年。 硫酸安普霉素为10%水溶性粉剂，购自山东济南华神动物药业有限公司，批文号：兽药字151152745，生产批号20191002。

1.3 试验设计 选择4 月龄24 只土鸡随机分成4 组，1 组为肠杆灵散试验组，2 组为空白对照组，3 组为球虫血痢散试验组，4 组为硫酸安普霉素试验组； 除对空白对照组按正常饲料喂养外， 试验1、3 组分别按每只鸡2 g/d 中草药纯粉拌饲料自由采饲，试验4 组按100 g 兑水150 kg 比例白天自由饮水；各药物试验组连续给药1 周，第8 天停药让药物代谢， 第9 天屠宰取食糜样本进行高通量测序。 试验分组及给药方案见表1。

表1 试验动物分组及给药方案

1.4 鸡肠道微生物菌群宏基因组检测

1.4.1 样品采集 将鸡屠宰后取后1/3 大肠段内容物于15 mL 无菌无酶EP 管中，-80 ℃超低温冰箱保存备用。 将采集的肠道内容物样品用干冰保存送往北京诺禾致源生物信息科技有限公司试验检测，针对样品进行PCR 测序。

1.4.2 样品细菌总DNA 提取 采用CTAB 或SDS 方法对样本的基因组DNA 进行提取， 之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的纯度和浓度，取适量的样品于离心管中， 使用无菌水稀释样品至1 ng/μL。以稀释后的基因组DNA 为模板，根据测序区域的选择， 使用带Barcode 的特异引物进行PCR， 确保扩增 效率和准确性 （DeSantis 等，2006）。

1.4.3 PCR 扩增建库 根据PCR 产物浓度进行等量混样， 充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，对目的条带使用qiagen 公司提供的胶回收试剂盒回收产物。使用DNA 黏合酶将测序接头连接在扩增好的DNA 片段两端， 使用AMpure PB 磁珠对DNA 片段进行纯化选择，构建SMRT Bell 文库。 纯化后的片段经buffer 回溶后，使用BluePipin 片段筛选特定大小的片段，并利用AMpure PB 磁珠对DNA 片段进行纯化。构建好的文库经Qubit 浓度定量，并利用Agilent 2100 检测插入片段大小，随后用PacBio 平台进行测序（Ondov 和Nicholas，2011）。

1.4.4 宏基因组测序 利用PacBio 测序平台对目的片段进行高通量测序， 根据barcode 序列区分各样本的数据（Li 等，2013），得到的Reads 需要进行去除嵌合体序列的处理，Reads 序列通过（UCHIME Algorithm）（Lozupone 等，2011） 与全长注释数据库进行比对检测嵌合体序列， 并去除其中的嵌合体序列（Lozupone 等，2007），得到最终的有效数据（Clean Reads）。 并对测序结果进行生物信息学分析， 阐述各组试验动物肠道微生物的种类与结构，及解析肠道微生物对药物反应的影响。

1.5 数据处理与分析 利用CCS 软件对序列进行校正， 得到最终有效数据（Edgar，2013；Quast等，2013）。 再通过去杂拼接、质量控制、筛选并去除嵌合体序列步骤后， 使用Uparse 软件（Magali等，2013）将序列聚类默认为97%的一致性（Identity）成为OTUs。 计算丰度指数和多样性指数，并进行主坐标分析（Wang 等，2007）， 采用SPSS 进行方差分析。

2 试验结果

2.1 对鸡大肠微生物菌群多样性的影响 由表2可知，R1、R3 及R4 各药物试验组的OUT 数量分别为54.33、50.33 和33.67， 数量最少的是R2 空白对照组，为25.67，说明药物试验组服药后可使鸡肠道微生物菌群多样性提高，微生物种类增多，均匀性更高，并且各组样品之间存在差异。组间样品 中R1 （ACE=58.48，Chao1=66.67，Shannon=3.17） 和R3 （ACE=50.33，Chao1=87，Shannon=3.11）组菌群多样性指数显著高于R4 组和R2 空白对照组，R2 空白对照组 （ACE=43.96，Chao1=51.33，Shannon=1.68）最低。

表2Alpha 多样性分析也指出，3 组服用药物鸡只的肠道内容物中肠道菌群的多样性均高于空白对照组，各组之间存在显著差异（P＜0.05）。R1、R3、R4 药物试验组的Shannon 指数分别为3.17、3.11和2.97，R2 空白对照组为1.68，表明R1、R3、R4 组肠道的微生物多样性高于对照组。 而R1、R3、R4 药物试验组的Simpson 值分别为0.6301、0.6336和0.6381，R2 空白对照组为0.6934， 表明各药物试验组的肠道微生物多样性也高于试验对照组 （Simpson 值越低表示菌落多样性越高）；从ACE 值（60.09）显示，R3 组最为突出；各组之间Coverage 的值均在0.97 以上，说明样品序列中未被检测到的可能性极低。

表2 各组样品中菌群的OTU 值及Alpha 多样性

2.2 主坐标分析（PCoA） 主坐标分析反映各样本中菌群构成的相似性。 基于Weighted Unifrac距离和Unweighted Unifrac 距离来进行PCoA 分析（Muscle，2004；McArdle 等，2001），并选取贡献率最大的主坐标来进行作图展示。 如果样品距离越接近，表示物种组成结构越相似，因此群落结构相似度高的样品倾向于聚集在一起， 群落差异大的样品则会远远分开。在本试验条件下，各试验组检测样本中菌群落分布区域不同， 而各自重复点相对能靠拢在一起（图1a），说明处理间群落构成存在差异性。 基于Weighted Unifrac 距离的PCoA分析结果显示 （图1b），R2 组与R1、R3 组和R4组间距离较远， 表明R2 组与R1、R3 组及R4 组间的菌落构成差异较大，R1 组、R3 组和R4 组之间的菌落构成差异较小。

图1 各组样品中Unweighted Unifrac距离PCoA 分析

2.3 基于门分类水平的分析 4 组样品中的菌群组成在门（phylum）水平上最大丰度排名前10 的物种水平见表3 和图2。 各组样本生成的OUT 主要由变形杆菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、梭杆菌门（Fusobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、螺旋体菌门（Spirochaetes）6 个门构成，其中以变形杆菌门（Proteobacteria）、厚 壁 菌 门（Firmicutes）2 个 菌 门占主导地位，所占比例在80%以上。 其他门类占比均不足1%；空白对照R2 组主要检测到的变形菌门占比显著高于试验R1 组、 R2 组和R3 组；厚壁菌门（Firmicutes）所占比例显著低于R1 组、R3 组和R4 组。 由此可见，各试验组用药后鸡只肠道菌群的组成结构较空白对照组发生了明显变化，其中，变形菌门均呈显著下降趋势，厚壁菌门占比呈显著上升趋势（P< 0.05），均有利于增加厚壁杆菌门（Firmicutes）的数量，从而使肠道菌群的平衡紊乱得到改善。

表3 各组样品对肠道微生物在门水平上的影响

2.4 基于种分类水平的分析 4 个试验组检测样品中菌群组成在种（species）水平上以最大丰度排名前10 如表4。 结果显示， 以非解乳糖链球菌FGM（Streptococcus）、盲肠肠球菌（Enterococcuscecorum）、大肠杆菌（Escherichia-coil）、唾液乳杆菌（Lactobacillus-salivarius）、 约氏乳杆菌（Lactobacillus-johnsonil）、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillusreuteri）6 种菌种为主。R1 组主要优势菌种为非解乳糖链球菌FGM（49.7%）、盲肠肠球菌（4.1%）、唾液乳杆菌（8.7%）、约氏乳杆菌（14.6%）、罗伊氏乳杆菌（2.7%），其中非解乳糖链球菌FGM 所占比例显著高于其余三个试验组。R3 组主要优势菌种为非解乳糖链球菌FGM （21.2%）、 盲肠肠球菌（6.2%）、 唾液乳杆菌 （11.2%）、 约氏乳杆菌（9.2%）、罗伊氏乳杆菌（4.2%）；R4 组主要优势菌种为非解乳糖链球菌FGM（40.8%）、唾液乳杆菌（7.8%）、 约氏乳杆菌 （9.1%）、 罗伊氏乳杆菌（7.7%）； 空白对照R2 组主要优势菌种为非解乳糖链球菌FGM（22.8%）、盲肠肠球菌中（16%）、唾液乳杆菌（7.4%）、约氏乳杆菌（7.2%）。表明R1 组可显著提升非解乳糖链球菌FGM、约氏乳杆菌的比例；R1、R3、R4 药物试验组对降低埃希氏-大肠杆菌的比例均优于R2 组， 且肠道内优势菌属数量增多；虽然R4 组能显著降低肠道内埃希氏-大肠杆菌比例， 但微生物种类含量比例低于药物试验R1 组和R4 组，且均匀性低。

表4 各组样品对肠道微生物在种水平上的影响

3 小结与讨论

本试验研究结果表明，试验用“球虫血痢散”、“肠杆灵散”和硫酸安普霉素药物能显著增加鸡肠道有益菌群中的厚壁菌门丰度比例， 降低变形杆菌门在菌群中的比例。 其中“肠杆灵散”试验组中非解乳糖链球菌FGM 的丰度占比为49.7%，是本组试验中鸡肠道内丰度比例最高的的菌群， 属于肠道有益菌， 这与研究报道一致 （吴开开等，2020）。 同时3 个药物试验组对降低埃希氏-大肠杆菌的比例显著优于空白对照试验组。 由此表明3 个试验药物对抑制鸡大肠杆菌感染和调整鸡肠道菌群平衡紊乱具有较好作用。

Alpha 多样性分析结果显示，在本试验条件下，3 个试验药物使用后的OUT 数量分别为54.33、50.33 和33.67， 显著高于空白对照组的25.67， 表明用药后鸡肠道菌群结构均发生了显著改变；Shannon 指数表明各药物试验组的肠道微生物多样性高于试验对照组（Simpson 值越低表示菌落多样性越高）；但从ACE 值显示，“球虫血痢散”、“肠杆灵散”兽用中草药试验组的ACE值分别为60.09 和58.48， 显著高于硫酸安普霉素试验组（47.18）。 由此表明，2 个兽用中草药制剂使用对调整鸡肠道菌群结构和多样性维持影响要显著优于硫酸安普霉素抗生素， 为2 个兽用中草药制剂的药物作用机理提供了重要的科学理论依据。

目前，随着我国养鸡产业的规模化发展和数量的不断增大，因养殖环境局部污染、饲养管理不当和营养因素导致鸡大肠杆菌病原发、 继发及混合感染呈上升态势， 加大了疾病防控的难度和药物防治成本。 同时，随着鸡肠道抗菌类化学药物、抗生素药物的广泛使用，细菌耐药性日益增强， 进一步加大了药物的使用量和增加了药物使用种类，并间接增加了药物的残留，形成了 “耐药性—加大用药量—残留增加—加大耐药性产生”的恶性循环。自国家卫生计划委等14部门联合制定的 《遏制细菌耐药国家行动计划（2016—2020 年）》 和农业农村部公布了2018—2021 年开展兽用抗菌药减量计划行动试点工作的通知以来，在饲料端禁抗、养殖端减抗和限抗大趋势下，寻求切实有效、可广泛应用的化学药物、抗生素替代方案势在必行。 目前市场上抗生素替代品种类繁多，如微生态制剂、抗菌肽、有机酸、多糖、植物提取物、植物精油、中草药、新型酶制剂等， 其中兽用中草药防治技术是我国目前畜禽养殖减抗、替抗的一个重要发展方向。试验用“球虫血痢散”和“肠杆灵散” 兽用中草药制剂是针对养鸡生产上大肠杆菌原发和球虫病大肠杆菌继发感染现象， 按照传统中兽医“君、臣、佐、使”组方原则进行药物组方，对鸡大肠杆菌感染疾病均有显著防治作用， 本试验应用Miseq 高通量检测技术从鸡肠道菌群门和属水平上进一步分析和验证了其药物的有效性及功能优势， 对今后兽用中草药制剂的研发和技术集成创新研究具有良好的指导意义。