小球藻液体肥料对3种植物生长促进作用的探究

2022-06-18钟慧祺冷立健周文广

生物学杂志 2022年3期

钟慧祺，韩佩，芦骞，冷立健，黎俊，周文广

(1.南昌大学资源环境与化工学院鄱阳湖环境与资源利用教育部重点实验室，南昌 330031；2.中南大学能源科学与工程学院，长沙 410083)

我国是农业生产的大国，化肥在农业生产过程中有重要作用，但化肥超标使用不仅造成土壤板结、盐碱化等现象，还带来土壤污染、地下水污染等一系列问题[1-3]，微生物肥料能够较好地解决传统化肥带来的问题。微藻是一类结构简单、适应能力强的光合自养微生物，不仅富含大量的氮磷营养元素，还含有微量元素和促进植物生长的物质，如维生素、类胡萝卜素、氨基酸和抗真菌物质等，使其在微生物肥料领域得到越来越多的关注[4-6]。当微藻用作微生物肥料时，能够通过逐步释放氮、磷和钾有效防止养分流失，从而满足植物生长需求[7]，同时，微藻的细胞提取物和生长液中已被证明含有植物激素(如生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸和水杨酸)，这些物质对植物的生长发育都有着积极促进作用[8-10]。微藻肥料施用于粮食、果蔬、花卉等植物上能够促进种子萌发、提高产量、改善品质，同时能在一定程度上改善土壤质量[11-13]。Coppens等[14]的研究表明，施加微藻肥料能够通过增加糖类和胡萝卜素含量来改善水果品质。刘淑芳等[15]的研究结果表明，施用小球藻藻液及处理液能够有效促进黄瓜的生长和开花，并且显著地改善土壤品质。

目前有关微藻生物肥料的研究大都集中在具有固氮能力的蓝藻以及海藻上，但是未经处理的水华蓝藻会释放藻毒素从而对农业生产造成影响，使其推广应用受到限制[16]；而国内海藻肥研制起步较晚且相关研究相对匮乏，其生产工艺发展缓慢，致使海藻肥在国内肥料市场的占有率相对较低，缺乏市场竞争力[17]。相比之下，小球藻生长速度快、固氮能力强、不会分泌藻毒素[16]，可以充分回收废物流中的养分，同时可以在干旱地区养殖，做到全年生产，具有作为肥料应用的潜力。本研究选取观赏性强、较为常见的铜钱草(Hydrocotylevulgaris)、绿萝(Epipremnumaureum)作为水培实验植物，选取广泛栽培、采收期长的辣椒(CapsicumannuumLinn)作为土培实验植物，分别对这3种植物施用小球藻肥料，观察其对植物生长和土壤理化性质的影响，以期为进一步探究小球藻肥料对植物生长及土壤品质改善提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 藻种

实验所用小球藻从南昌某垃圾填埋场及周边环境的水样中筛选而来，经分离纯化得到3株纯种，分别编号NCU-2、NCU-3、NCU-5，小球藻的保种及扩培均采用灭菌后的TAP培养基，在温度(30±1)℃，光强度3～4 klx，连续光照的条件下培养，每天手动摇晃3次。

实验过程中所用的TAP培养基成分如下：2.42 g/L Tris盐；25.0 mL/L TAP盐(NH4Cl 15.0 g/L，MgSO4·7H2O 4.0 g/L，CaCl2·2H2O 2.0 g/L)，0.375 mL/L磷酸盐溶液(K2HPO428.8 g/L，KH2PO414.4 g/L)，1.0 mL/L冰醋酸，1.0 mL/L Hutner微量元素[EDTA二钠盐50.0 g/L，ZnSO4·7H2O 22.0 g/L，H3BO311.4 g/L，MnCl2·4H2O 5.06 g/L，CoCl2·6H2O 1.61 g/L，CuSO4·5H2O 1.57 g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.10 g/L，FeSO4·7H2O 4.99 g/L]。

1.1.2 植物

水培实验选取绿萝、铜钱草两种植物，均购自南昌市某花鸟市场。土培实验选取朝天椒，辣椒幼苗购自南昌市某农贸基地。

1.1.3 土培容器与实验土壤

土培容器选用内径大小约为20 cm的圆形塑料花盆，实验土壤来自南昌大学校园，均质化处理后用于实验。

1.2 实验设计

1.2.1 铜钱草水培实验

在正式实验前，通过预实验初步探索了小球藻液体肥料不同添加浓度对水培植物生长的促进作用，发现当水溶液中小球藻液体肥料的终浓度为0.05 g/L时，促进效果最为明显，因此正式水培实验中使小球藻液体肥料的添加终浓度均为0.05 g/L，以TAP培养基与清水(CW)为实验对照。

选取3种小球藻(NCU-2，NCU-3，NCU-5)进行实验，采用小球藻破碎液(FL)和小球藻藻液(CS)两种藻肥形式，共设置6个实验组，分别编号为2-CS、2-FL、3-CS、3-FL、5-CS、5-FL，对照组为TAP与CW，每组设置3个平行，每7 d加肥一次。

1.2.2 绿萝水培实验

选取小球藻NCU-2进行实验，采用FL与CS两种藻肥形式，共设置2个实验组，分别编号为2-CS、2-FL，对照组为TAP与CW，每组设置3个平行，每5 d加肥一次。

1.2.3 辣椒土培实验

选取小球藻NCU-2进行实验，设置两个添加量：0.04 g和0.004 g小球藻(干重)，藻肥以CS与FL两种形式添加，分别编号为2-CS-a、2-FL-a、2-CS-b、2-FL-b，对照为CW，每组设置3个平行。每7 d加肥一次，添加体积均为150 mL，直接将其倾倒至植株根部使根部周围的表层土壤湿润。

1.3 方法与测量指标

1.3.1 小球藻生物量的测定

将藻种液转接至TAP培养基中(接种比例1∶20)，每隔24 h取藻液测定其在679 nm波长下的数值OD679，以TAP培养基为参比读零。同时取3～5 mL藻液，在0.7 μm玻璃纤维滤膜上进行抽滤，滤膜事先已105 ℃烘至恒重(m1)。将留有藻泥的滤膜在105 ℃中烘干8 h，直到恒重(m2)，得到干重(m=m2-m1)。将各组OD值与对应的单位体积干重(即生物量，g/L)进行线性拟合，得出小球藻生物量(y)与OD值(x)的线性关系，即为该种小球藻的标准曲线。之后即可通过测定藻液的OD679数值换算出相应生物量。

1.3.2 微藻肥料的制备

取培养至对数生长期的小球藻测定其OD679，再通过该小球藻的标准曲线换算成生物量，根据实验添加的浓度要求计算出所需的藻液体积V，然后离心(4 000 r/min，10 min)得到藻泥，用蒸馏水冲洗藻泥并充分混合后再次离心，以排除小球藻肥料中培养基的影响，重复2～3次后得到纯净小球藻藻泥。

根据计算好的浓度体积，向离心洗净后的小球藻泥中加入相应体积的蒸馏水，得到所需浓度的小球藻藻液肥料，另取同等体积的藻液通过超声波细胞破碎仪处理得到小球藻破碎液(单次破碎体积：100 mL，破碎时间：20 min；功率70%，占空比50%)。

1.3.3 测量指标

(1)水培实验中，铜钱草的测量指标为叶片数增量(Δq)、叶片总面积增量(ΔS1)，绿萝的测量指标为叶片数增量(Δq)、叶片总面积增量(ΔS2)和茎长增量(ΔL)。各项指标的含义及计算方式如下所示：

Δq=qn-q0

式中：qn为加肥n次后的叶片数量；q0为初始叶片数量，q0=2；

ΔS1=Sn-S0(S=πd2/4)

ΔS2=Sn-S0(S=长×宽×0.75)

式中：Sn为加肥n次后的叶片总面积，cm2；S0为初始叶片总面积，cm2；d为叶片直径，cm；0.75为修正系数；

ΔL=Ln-L0

式中：Ln为加肥n次后的茎长，cm；L0为初始茎长，cm；

(2)土培实验中，辣椒的测量指标为株高增量(Δh)、茎粗直径增量(Δd)和果实数量(n)。各项指标的含义及计算方式如下所示：

Δh=hn-h0

式中：hn为加肥n次后的茎长，cm；h0为初始茎长，cm；

Δd=dn-d0

式中：dn为加肥n次后的茎粗，mm；d0为初始茎粗，mm；n：各处理组辣椒在实验期间多次结果数量累加后的均值。

1.3.4 土壤理化性质测定

在辣椒实验前后对土壤进行采样，采用重铬酸钾氧化-外加热法测定土壤有机质含量；采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定土壤速效磷含量；采用乙酸铵浸提火焰光度计法测定土壤速效钾含量；采用碱解扩散法测定土壤碱解氮含量。

1.4 数据分析

实验结果以平均值±标准差表示，应用单因素方差分析进行显著性分析，并以LSD法对数据进行比较分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 3种小球藻的标准曲线

根据小球生物量的测定方法，得到3种小球藻吸光度与干重的拟合曲线：NCU-2干重(g/L)=0.288 3×OD679+0.007 3，R2=0.999 7；NCU-3干重(g/L)=0.322 2×OD679+0.002 9，R2=0.998 7；NCU-5干重(g/L)=0.465 8×OD679-0.007 5，R2=0.994 7。

2.2 铜钱草水培实验结果与分析

实验过程共计加肥5次，结束后得到的数据如图1所示。

由图1可知，与清水对比，小球藻NCU-2藻液及其破碎液对铜钱草的叶片总面积均有明显促进作用(P<0.05)，2-CS的ΔS1比CW增长367.08%，2-FL的ΔS1比CW增长354.61%；小球藻NCU-5藻液对铜钱草的叶片总面积有明显促进作用(P<0.05)，破碎液则无显著促进作用(P>0.05)，5-CS的ΔS1比CW增长7 351.33%；小球藻NCU-3破碎液对铜钱草的叶片总面积有一定促进作用(P<0.05)，3-FL的ΔS1比CW增长256.02%。同时，3种小球藻藻液及破碎液对铜钱草的叶片数均无显著促进作用(P>0.05)。

(a)叶片数增量Δq；(b)叶片总面积增量ΔS1。CS：藻液，FL：破碎液，TAP：培养基，CW：清水；数据共有相同的字母上标，表示差异性不显著(P>0.05)。

不同小球藻之间的促生长效果差异，可能是本身性质的不同所造成的，通过对3种小球藻藻液及其破碎液中总氮、总磷进行分析(表1)可以发现，不同形式小球藻中总氮、总磷的含量有明显差异，因此当3种小球藻被用作肥料时，所能提供给植物的养分也不尽相同，从而使铜钱草的生长呈现出明显差异，各组铜钱草的生长差异也可从实际照片中得到体现，见图2。

表1 3种小球藻藻液及其破碎液中总氮、总磷含量

(a)2-CS;(b)2-FL;(c)TAP;(d)3-CS;(e)3-FL;(f)TAP;(g)5-CS;(h)5-FL;(i)TAP;(j)CW。2-CS为小球藻NCU-2；3-CS为小球藻NCU-3；5-CS为小球藻NCU-5。CS：藻液；FL：破碎液；TAP：培养基；CW：清水。图2 5次加肥后铜钱草实际生长状况

从藻肥形式上看，NCU-2和NCU-5藻液对铜钱草生长的促进效果均比破碎液明显，推测是破碎处理使小球藻内容物完全释放至水溶液中，增加了铜钱草在培养过程中感染杂菌的概率，而培养液受到污染将会影响铜钱草对养分的吸收[18]，相比之下藻液则能够在相对较长的时间内缓慢分解成可被植物利用的小分子养分，稳定持久地为铜钱草的生长提供养分。与CW相比，TAP培养基中含有大量游离的K+、Ca2+等离子，这些离子能够被植物根系直接吸收利用，从而使TAP培养基呈现一定的促生长作用。

综上所述，发现小球藻NCU-2藻液及破碎液、小球藻NCU-5藻液均对铜钱草有明显的促生长作用，而小球藻NCU-2的整体促生长效果好于小球藻NCU-5，故后续实验中将以小球藻NCU-2为主要研究对象，继续探讨小球藻对不同植物生长的促进影响。

2.3 绿萝水培实验结果分析

实验过程共计加肥12次，实验结束后得到的数据如图3所示。由图3可知，与清水对比，小球藻NCU-2藻液对绿萝的3个生长指标有显著促进作用(P<0.05)，同时其破碎液对叶片数与茎长也表现出明显促进作用(P<0.05)。在叶片数增量方面，2-CS与2-FL数据接近，均远大于两个对照组；在叶片总面积增量方面，2-CS的ΔS2达134.713 cm2，比TAP、CW分别增长76.67%、123.70%，2-FL组次之，比TAP、CW分别增长34.99%、70.92%；在茎长增量方面，2-CS、2-FL、TAP 3组数据之间差异较小，但比CW分别增长76.31%、67.78%、56.25%。

(a)叶片数增量Δq;(b)叶片总面积增量ΔS2;(c)茎长增量ΔL。CS：藻液；FL：破碎液；TAP：培养基；CW：清水。图中数据共有相同的字母上标，表示差异性不显著(P>0.05)。

植物可以利用二氧化碳和水在光照条件下形成碳水化合物，而其他元素则必须从环境中获得，如氮、磷、钾、钙、镁等，其中钾是维持植物体内平衡的关键因子，不仅维持细胞渗透压，还可以促进纤维素和木质素的合成，使植物的茎变得强壮[18]。因此，TAP培养基也对绿萝的生长，特别是茎的生长起到促进作用，这与前述铜钱草实验的结果一致。

在正常水培环境下，绿萝新叶生长大约需要20 d[19]，可以发现小球藻肥料的添加加快了绿萝叶片的生长速度，并且在一定程度上使绿萝叶片面积得到更大程度的增长，通过绿萝的实际生长状况图(图4)可以很清楚地看出各处理组之间的差异。

(a)2-CS;(b)2-FL;(c)TAP;(d)CW。2-CS为小球藻NCU-2的藻液；2-FL为小球藻NCU-2的破碎液；TAP：培养基；CW：清水。

综上，0.05 g/L小球藻NCU-2对绿萝的生长具有明显促进作用，且藻液的效果明显好于破碎液，这与铜钱草实验的结果基本一致。除去藻液能够避免培养液污染的原因外，绿萝实验中藻液效果更好的原因可能是由于绿萝的木质化程度较高，而植物木质化程度越高，所需养分也就越复杂，而小球藻藻液含有多种生物活性物质，如细胞分裂素等[6,20]，这使得小球藻能够稳定持久地为绿萝的生长提供充足的养分。另一方面，小球藻中丰富的营养物质并不能完全被水培植物吸收利用，许多大分子物质需要依靠多种微生物分解后才能被植物利用，而水培环境一般为无菌或少菌，因此本研究还进一步探索了小球藻NCU-2对土培植物生长的影响。

2.4 辣椒土培实验结果分析

(1)辣椒生长指标分析。实验过程共计加肥10次，期间采收辣椒果实3次，整个实验过程中并未发现有烧根、烧叶或果实畸形等不良现象，说明施加不同量的小球藻NCU-2并没有对辣椒的生长发育造成不良影响，而通过实验结束后得到的数据(图5)可以发现，小球藻NCU-2对辣椒的生长发育有积极影响。

由图5可知，与清水对比，除0.004 g小球藻藻液以外，其余3种小球藻肥料对辣椒的株高有明显促进作用(P<0.05)，2-CS-a效果最好，其次是2-FL-a、2-FL-b，与CW相比，各处理组分别增长18.06%、15.28%、13.27%；两种浓度小球藻NCU-2藻液对辣椒结果数量有明显促进作用(P<0.05)，与CW相比，2-CS-a增长112.12%，2-CS-b增长48.48%；除0.004 g小球藻藻液以外，其余3种小球藻肥料对辣椒的茎粗直径均无显著促进作用(P>0.05)。

(a)株高增量Δh;(b)茎粗直径增量Δd;(c)果实数量n。2-CS-a为小球藻NCU-2的藻液(0.04 g)；2-CS-b为小球藻NCU-2的藻液(0.004 g)；2-FL-a为小球藻NCU-2的破碎液(0.04 g)；2-FL-b为小球藻NCU-2的破碎液(0.004 g)；CW：清水。图中数据共有相同的字母上标，表示差异性不显著(P>0.05)。

从藻肥形式与添加量来看，小球藻NCU-2藻液和破碎液的促进效果与其添加量有关，当添加量为0.04 g干重/次时，2-CS-a在株高、茎粗直径和果实数量的促进效果均优于2-FL-a，分别高出2.40%、5.18%、32.07%；当添加量为0.004 g干重/次时，2-FL-b则比2-CS-b更具有优势，株高增量、茎粗直径和果实数量分别高出5.01%、0.56%、18.37%。可以发现如果采取不同形式的小球藻肥料灌根处理辣椒并欲使其达到最佳效果，则需要根据具体情况调整添加量，这一发现对后续小球藻肥料投入实际生产应用有一定的启发。

实际农业生产经验证实辣椒喜温、喜水、喜肥，但高温易得病，水涝易死秧，肥多易烧根[21]。同时辣椒生长期长，根系弱，且在生长发育的不同阶段对养分需求不一，苗期氮肥和钾肥不宜过多，以免延迟花芽分化和结果，而磷对花的形成和发育具有重要作用，钾又是果实膨大必需的元素[22]，因此实际生产中需要做到氮、磷、钾配合施用。除需要大量元素外，辣椒对硼等微量元素也比较敏感，若缺硼，则叶色发黄，花期延迟，花而不实，产量降低[21-22]。而前述实验结果表明小球藻NCU-2对辣椒的生长发育具有积极影响，施加小球藻肥料能够在前期使辣椒株高与茎粗直径得到增长，并且使最终果实数明显增加，说明小球藻NCU-2不仅能够提供辣椒生长所需的氮、磷、钾等大量营养元素，还能够提供微量元素及其他生物活性物质，验证了小球藻NCU-2能够促进对土培植物生长。

(2)土壤理化性质分析。结合前述分析，从两种不同形式的小球藻处理组中选取实验效果较好的2-CS-a、2-FL-b进行土壤采样，并与对照组土壤样品及原始土样一起进行理化性质测定，结果如表2所示。

由表2可知，CW的各项指标均下降，说明正常条件下，辣椒在生长过程中会将土壤中的有关营养物质吸收利用，辣椒属于喜钾类作物[21-22]，故土壤中速效钾含量下降明显。

表2 不同处理组土壤中氮、磷、钾及有机质含量

与CW对比，施用0.004 g小球藻NCU-2破碎液对土壤碱解氮、速效磷、速效钾、有机质含量的增加有明显作用(P<0.05)，各项指标分别增加了2.61%、18.50%、18.52%、14.98%；而施用0.04 g小球藻NCU-2藻液仅对土壤速效钾、有机质含量的增加有明显作用(P<0.05)，分别增加11.30%、20.04%，但土壤碱解氮、速效磷的降低也呈现显著性差异(P<0.05)，这说明土壤中大量的氮、磷元素被辣椒所吸收，这与前述2-CS-a促生长效果最好的实验结果相吻合。而辣椒在结果时期对钾元素的需求更加旺盛，但实验结束后2-CS-a的速效钾、有机质含量却呈现增长，说明小球藻肥料中含有的营养成分远超过辣椒的生长需求，除去被辣椒生长吸收利用外，小球藻肥料的添加还使土壤中不能被利用的养分通过微生物的新陈代谢作用释放出来，进而转化为可以被植物所吸收的养分[23-25]，从而提高了土壤中营养物质含量，甚至使其中的速效钾、有机质含量基本恢复到原始土样的含量水平。

与此同时，2-FL-b各项指标均为最高，推测可能是破碎处理使小球藻的内容物充分分散至破碎液中，这些营养元素又通过根灌处理扩散至土壤中，除被辣椒吸收的部分外剩余的则滞留于土壤中，从而使碱解氮、速效磷、速效钾、有机质含量明显上升。但是在促进辣椒生长方面，2-FL-b整体效果不如2-CS-a，尽管破碎处理使各种营养物质流出，但同时也会让某些活性物质失去活性，影响小球藻肥效的发挥，而小球藻藻液则通过活体代谢或死亡的方式逐步释放胞内养分，因此对植物供养较缓慢但肥力较持久[26-28]，使得2-CS-a最终的促生长效果好于2-FL-b。

综上，施加0.04 g小球藻NCU-2藻液不仅明显促进辣椒前期的生长和后期的结果，还能对土壤理化性质起到一定调节作用，对耕地可持续发展具有重要意义。