1,25(OH)2D3通过调节氧化还原状态影响猪前体脂肪细胞分化

田程程，张 晶，符 璐，蒋苏苏,2，武殿虎，卢建雄，张国华*

（1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.甘肃农业职业技术学院，甘肃 兰州 730020）

脂肪形成是前体脂肪细胞增殖及分化为成熟脂肪细胞的复杂过程。在经历了形态学和生物化学变化后前体脂肪细胞分化脂肪细胞，参与脂肪合成、脂肪酸跨膜转运及胰岛素信号应答等多种生物学过程。脂肪细胞数量的增加和体积的增大是动物体脂沉积的生物学基础，其调控机制备受关注。遗传因子、营养、氧化还原状态等多种内、外环境因素都会影响脂肪细胞分化。维生素D不仅作为营养物质可以调节钙磷代谢，也具有调节免疫功能、抑制肿瘤生长和调控细胞分化发挥激素类物质的作用。它是一组具有生物活性的脂溶性类固醇衍生物[1]，在肝脏经25-羟化酶CYP2R1和CYP27A1作用转变成25(OH)D3，然后在肾脏由1α羟化酶CYP27B1催化为1,25(OH)2D3。24-羟化酶CYP24A1可将1,25(OH)2D3分解为水溶性代谢产物d3-23羧酸（calcitroic acid）排出体外。25(OH)D3和1,25(OH)2D3是维生素D主要的生物活性形式，也是维生素D受体（Vitamin Dreceptor）的天然配体[2]。当1,25(OH)2D3与其受体结合后，可诱导多种细胞增殖、分化及凋亡相关基因表达[3]。1,25(OH)2D3以剂量依赖方式下调3T3-L1前体脂肪细胞转录因子增强子结合蛋白α（C/EBPα）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）及其下游脂代谢相关基因LPL和aP2等的表达，抑制成脂分化[4]。用25(OH)D3或1,25(OH)2D3处理可抑制乳腺前体脂肪细胞分化过程的启动[5]。脂肪组织是维生素D主要的贮存场所之一，日粮多不饱和脂肪酸通过调控维生素代谢酶的表达影响猪脂肪组织维生素D代谢，从而调节脂肪合成[6]。研究发现，低浓度的1,25(OH)2D3通过降低PPARγ的表达，可减弱猪前体脂肪细胞分化，但高浓度的1,25(OH)2D3通过提高PPARγ的表达，可增强分化[7]，但其作用机制尚不清楚。

硫氧还蛋白（thioredoxin,Trx）氧化还原系统是机体重要的抗氧化系统，参与细胞氧化还原状态的调节[8]，对机体健康和代谢起着重要作用。硫氧还蛋白互作蛋白（Txnip）是一种维生素D3上调蛋白1（Vitamin D3up-regulated protein 1,VDUP1），可通过抑制硫氧还蛋白的还原活性调节细胞氧化还原状态[9]，调控脂肪细胞分化[10]。因此，维生素D可能通过调控细胞氧化还原影响脂肪细胞分化。本试验通过分离培养猪前体脂肪细胞，分析不同浓度1,25(OH)2D3对细胞分化及氧化还原平衡状态的影响，探讨维生素D调控猪脂肪细胞分化的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

牛血清白蛋白（Gibco，美国）；地塞米松（DEX）、1,25(OH)2D3、胰岛素（Sigma公司）；DMEM/F12 培养基、胎牛血清（HyClone，美国）；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、油红O、台盼蓝和DMSO（Solarbio公司，北京）；RNA提取、反转录及PCR试剂盒（TaKaRa公司，日本）；PCR引物由上海生工生物工程公司合成；3日龄仔猪（Sus scrofa）购自兰州瑞源农业科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 皮下前体脂肪细胞培养及诱导分化 3日龄仔猪体表清洗、消毒后乙醚麻醉处死，按本实验室已建立的脂肪细胞分离、培养方法[11]，无菌条件解剖分离皮下脂肪组织，PBS漂洗，剪成组织小块，用浓度1%的Ⅰ型胶原酶在37 ℃水浴中消化60 min左右后，等体积完全培养液终止消化，100目筛网过滤。收集滤液，1 000 r/min离心10 min，沉淀用培养液漂洗后，用10%血清培养液重悬细胞，然后以6×104/cm2密度接种于24孔板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。隔天换液。细胞生长至约80%汇合后，用成脂分化培养液培养48 h，然后换用1,25(OH)2D3终浓度为0 nmol/L（对照）、0.1 nmol/L和100 nmol/L的维持培养液培养，隔日换液，于成脂诱导后2 d、4 d、6 d、8 d和10 d检测细胞分化及提取总RNA。

1.2.2 油红O染色提取法检测细胞分化 分别在诱导成脂分化的2 d、4 d和6 d，按于淇等[10]报道的油红O染色提取法，测定为510 nm的吸光度值。

1.2.3 细胞氧化还原指标检测 诱导分化后第6 d，在每孔细胞中加入1 ml胰酶消化，收集细胞，用冰冷的PBS洗涤3次后，反复冻融裂解细胞，4 ℃、1 000 r/min离心10 min，收集上清液，用猪活性氧（ROS）、还原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）酶联免疫吸附测定试剂盒（上海江莱生物科技有限公司），按照使用说明书测定ROS、GSH和GSSG。

1.2.4 基因mRNA表达检测 诱导分化6 d的细胞弃培养液后，用试剂盒提取总RNA，反转录合成cDNA。按生产商使用说明书，制备实时荧光PCR反应混合液（20 μl），包括上、下游引物（10 μmol/L）各1 μl、cDNA 2 μl。引物信息见表1，反应程序见文献[11]。用2-ΔΔCt法计算基因相对表达水平，β-actin作为内参。

表1 引物序列

1.2.5 统计分析 用SPSS 20.0统计软件对试验数据进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较，试验结果用平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 1,25(OH)2D3对猪前体脂肪细胞分化的影响

猪前体脂肪细胞成脂诱导后，分别以0.1 nmol/L和100 nmol/L 1,25(OH)2D3处理。成脂诱导6 d后脂肪细胞油红O染色结果见图1。在成脂诱导2 d、4 d和6 d后，0.1 nmol/L 1,25(OH)2D3处理组细胞的分化水平显著低于对照组（P＜0.05），而100 nmol/L 1,25(OH)2D3处理组细胞的分化水平显著高于对照组（P＜0.05）（图2）。可见，低浓度1,25(OH)2D3抑制猪前体脂肪细胞分化，高浓度1,25(OH)2D3促进分化。

图1 成脂诱导6 d后猪脂肪细胞油红O染色结果

图2 1,25(OH)2D3对猪脂肪细胞分化的影响

2.2 1,25(OH)2D3对细胞氧化还原状态的影响

1,25(OH)2D3处理的猪前体脂肪细胞在成脂诱导6 d后，检测细胞ROS、GSH和GSSG水平，结果如表2所示。与对照组相比，0.1 nmol/L浓度1,25(OH)2D3处理极显著提高细胞ROS和GSSG水平（P＜0.01），极显著降低GSH水平及GSH/GSSG比值（P＜0.01），而100 nmol/L浓度1,25(OH)2D3处理极显著降低细胞ROS和GSSG水平（P＜0.01），极显著提高GSH水平及GSH/GSSG比值（P＜0.01）。

表2 1,25(OH)2D3对猪前体脂肪细胞氧化还原状态的影响

2.3 1,25(OH)2D3对细胞氧化还原相关基因表达的影响

采用实时荧光PCR检测诱导分化后6 d脂肪细胞Trx、SOD2和Prx3mRNA表达，结果如图3所示。与对照组相比，0.1 nmol/L浓度1,25(OH)2D3处理和100 nmol/L浓度1,25(OH)2D3处理均极显著降低Trx mRNA表达（P＜0.01）；100 nmol/L 1,25(OH)2D3处理显著上调SOD2和Prx3mRNA表达，但0.1 nmol/L 1,25(OH)2D3对其表达影响不显著。

图3 1,25(OH)2D3对猪脂肪细胞氧化还原相关基因表达的影响

3 讨论

脂肪组织是动物体内维生素D贮存的主要组织之一，其活性形式1,25(OH)2D3也以自分泌和旁分泌方式影响脂肪形成[12]。对啮齿动物来源的前体脂肪细胞3T3-L1和PA6等的研究表明，1,25(OH)2D3抑制其成脂分化及脂滴聚集[4]。Ji等[13]发现10～100 nmol/L浓度1,25(OH)2D3通过降低成脂关键因子PPARγ及其下游脂代谢相关基因表达，抑制3T3-L1前体脂肪细胞分化。尽管1,25(OH)2D3以剂量依赖方式降低PPARγ和C/EBPα表达，抑制3T3-L1细胞分化，但这种作用只发生在成脂分化起始阶段[4]。100 nmol/L 1,25(OH)2D3抑制3T3-L1细胞分化，但促进小鼠和人类原代培养前体脂肪细胞分化及PPARγ表达[14]。不同浓度1,25(OH)2D3对Ob17细胞成脂分化有不同的影响，低浓度时促进分化，高浓度时抑制分化[15]。但Lenoir等[16]得到相反结果，即维生素D浓度大于0.25 nmol/L时促进Ob17细胞分化，小于0.25 nmol/L时抑制分化。此外，1,25(OH)2D3以剂量依赖方式抑制猪皮下前体脂肪细胞分化[17]，但促进猪骨髓间充质干细胞成脂分化[18]。这些研究结果的分歧可能与细胞来源及1,25(OH)2D3的浓度有关。本试验结果表明，低浓度（0.1 nmol/L）1,25(OH)2D3抑制猪皮下前体脂肪细胞分化，而高浓度（100 nmol/L）促进分化。与此一致，岳小婧等[7]报道0.1～1 nmol/L 1,25(OH)2D3抑制猪前体脂肪细胞分化，而浓度为10～100 nmol/L时促进分化。

氧化还原系统是生物体内的一种重要调节机制，在细胞增殖、分化和凋亡过程中发挥着重要作用。氧化还原状态是超氧阴离子（O2−）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（OH）等活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）、二氧化氮（NO2）等活性氮（RNS），与酶系统和非酶系统组成的抗氧化防御系统之间相互作用的结果[19-20]。低浓度ROS和RNS是氧化还原信号的效应器，但积累过多以及抗氧化防御受损时，就会发生氧化应激，导致细胞功能及代谢改变[21]。谷胱甘肽（glutathione,GSH）是重要的亲水性抗氧化剂，可以通过非酶反应清除氧自由基，但GSH介导的过氧化氢还原需要谷胱甘肽过氧化物酶的催化[22]。GSH与氧化剂作用后形成的氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione,GSSG），在依赖NADPH的GSH还原酶和硫氧还蛋白氧化还原系统的作用下还原为GSH。GSH/GSSG是动物体主要的氧化-还原对之一，其比值可反映出细胞氧化还原状态的动态变化。猪前体脂肪细胞用低浓度1,25(OH)2D3处理时，细胞ROS和GSSG水平提高，GSH水平降低，导致GSH/GSSG比值显著降低，反映了低浓度1,25(OH)2D3导致细胞氧化还原状态向氧化态转变；相反，高浓度1,25(OH)2D3处理，猪前体脂肪细胞ROS和GSSG水平降低，而GSH水平及GSH/GSSG比值提高，表明细胞向还原态转变。研究表明，氧化应激通过降低C/EBP DNA结合活性抑制3T3-L1前体脂肪细胞分化[23]，H2O2处理可下调PPARγ表达，降低C/EBP DNA结合活性，抑制3T3-L1细胞分化[24]。由此可见，1,25(OH)2D3可通过影响细胞氧化还原状态调节猪前体脂肪细胞分化。

超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase，SOD2）是细胞内线粒体抵御ROS氧化损伤的重要抗氧化金属酶，催化超氧阴离子歧化生成过氧化氢和氧，发挥抗氧化作用。过氧化物氧化还原酶（peroxredoxins，Prxs）作为线粒体抗氧化酶，在3T3-L1成熟脂肪细胞活性较高，但在肥胖小鼠和人类肥胖者的脂肪组织中活性降低[25]。Prx3是调节脂肪细胞氧化应激和脂肪因子表达的关键分子，Prx3基因敲除后，3T3-L1细胞超氧化物水平升高，氧化应激调节异常[26]。提高SOD2和Prx3表达可清除过量产生的ROS[27-28]。在高浓度1,25(OH)2D3处理的猪脂肪细胞，SOD2和Prx3基因表达显著提高，可能意味着细胞代谢生成的过量ROS被清除，GSH/GSSG比值提高。相比之下，低浓度1,25(OH)2D3处理对Prx3和SOD2表达均无显著影响，细胞积累更多的ROS，GSH/GSSG降低。此外，Trx是硫氧还蛋白氧化还原系统的主要组成成分，Txnip通过抑制Trx的还原活性调节细胞氧化还原状态。1,25(OH)2D3显著提高猪脂肪细胞Txnip基因表达[29]。本研究中，1,25(OH)2D3显著降低猪脂肪细胞Trx mRNA表达，且高浓度1,25(OH)2D3比低浓度有更大幅度的下调，提示1,25(OH)2D3也可能通过改变Trx表达水平调节细胞氧化还原稳态，对猪前体脂肪细胞分化产生影响。

4 结论

1,25(OH)2D3可通过改变细胞氧化还原状态，影响猪前体脂肪细胞分化。高浓度1,25(OH)2D3上调SOD2和Prx3表达、减少细胞ROS积累，氧化还原状态向还原态偏移，促进猪前体脂肪细胞分化；相反，低浓度1,25(OH)2D3处理可使细胞ROS积累增加，氧化还原状态偏向氧化态，抑制猪前体脂肪细胞分化。