不同佐剂对口蹄疫灭活疫苗稳定性的影响

张 荣，武永淑，李 菁，安芳兰，刘学荣

（中农威特生物科技股份有限公司，甘肃 兰州 730046）

口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的一种急性传染病，主要感染偶蹄类动物，传播途径多，速度快，发病率高，目前已有67%的OIE成员国流行FMD，严重威胁着周边国家和地区的家畜安全及畜产品贸易。口蹄疫传入中国后，给我国畜牧养殖业也造成了巨大的经济损失[1]。疫苗免疫接种仍然是目前防控口蹄疫病毒感染的最有效手段和措施[2]，为有效防控传染病和推动畜牧业的发展提供了有力保障。目前市场上占主导地位的仍是口蹄疫灭活疫苗[3]，一些新型的疫苗也在不断被开发和应用[4]。佐剂是指与抗原同时使用，能够增强机体对抗原适应性免疫应答能力的一类物质[5]，是疫苗制备中至关重要的因素，能够提高疫苗对机体的保护力，减少疫苗用量，从而降低生产成本[6]。目前国内口蹄疫疫苗市场上应用最广泛的是法国SEPPIC公司的Montanide ISA 206佐剂[7-8]。国产佐剂规模化应用的还比较少，严重依赖国外进口，成本较高。中国是世界上公认的养猪大国，养殖量约占世界总量的50%，为了降低成本，选择一种可以代替进口佐剂、适用于口蹄疫灭活疫苗商业化应用的新型国产佐剂是口蹄疫疫苗生产厂家急需解决的问题。本研究通过利用3种不同佐剂与口蹄疫O型抗原（毒株）配制3组不同口蹄疫O型灭活疫苗，以ISA 206佐剂配制的疫苗作为对照组，Well佐剂和ISA 201佐剂作为试验组，比较评价这3组口蹄疫灭活疫苗的物理性状、146S含量变化及对猪的免疫应答水平，以期为口蹄疫疫苗厂家选择佐剂提供数据支持。

1 材料

1.1 抗原与佐剂

抗原：口蹄疫O型灭活抗原（MYA98/OM）（中农威特生物科技股份有限公司）。

佐剂：ISA 206佐剂和ISA 201佐剂（法国SEPPIC公司），Well佐剂（南京威尔药业集团股份有限公司）。

1.2 仪器与试剂

粒度分析仪（布鲁克海文），高速离心机（赛默飞世尔），酶标仪（Bio-Rad），顶置式搅拌器EUROSTAR 40（IKA），口蹄疫血清抗体检测ELISA试剂盒（中国农业科学院兰州兽医研究所）。

2 方法

2.1 乳化

将ISA 206佐剂、ISA 201佐剂以及Well佐剂分别于121 ℃高压灭菌30 min，同一批次的抗原在无菌条件下分成3份各50 g，146S含量为10 μg/ml，将以上3种佐剂和抗原分别置于31 ℃水浴中恒温30 min后，分别等质量混合，利用EUROSTAR 40搅拌器350 r/min乳化5 min，分装于疫苗瓶中编号待测。

2.2 物理性状检测

按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行性状检验[9]。

粘度检测：在25 ℃条件下，用1 ml吸管分别吸取上述3种不同的疫苗，垂直自然流出，计算0.4 ml流出所需要的时间。

离心检测：取10 ml疫苗于15 ml离心管中，以3 000 r/min转速离心15 min。

剂型检测：室温下，用移液器分别吸取上述3组疫苗各1 ml，快速滴于100 ml纯水表面，如果分散呈云雾状则为水包油包水。

粒径检测：以PBS作为稀释液，吸取2 μl疫苗于4 ml PBS中，吹打均匀，置于样品槽中利用粒度分析仪检测粒径大小。

稳定性试验：将3种疫苗分别存放在4 ℃和37 ℃环境下，在15 d、30 d、45 d和60 d观察其分层情况，并检测疫苗中146S含量变化。

2.3 免疫动物试验

将上述3种不同佐剂制备的口蹄疫灭活疫苗免疫35～45 kg的架子猪各10只，免疫剂量为0.2 ml，在免疫14 d、21 d、28 d、60 d、90 d、120 d和150 d分别进行静脉采血，用口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒检测血清中抗体含量，判断3组不同佐剂乳化的口蹄疫灭活疫苗对试验动物的整体免疫抗体水平。

3 结果及分析

3.1 物理性状检测

将Well、ISA 201和ISA 206 3种不同的佐剂分别与口蹄疫灭活抗原乳化成疫苗，物理性状检测均达到标准。吸取疫苗快速滴入水中，三者分散均呈云雾状，剂型为W/O/W型，见图1。3种疫苗的粒径分别为247 nm、234 nm、220 nm，见图2。离心未出现分层情况，粘度均在2～8 s范围内。

图1 3种疫苗的剂型检测

图2 3种疫苗的粒径大小

3.2 放置试验

将所制备的3种疫苗分别放置在4 ℃和37 ℃环境下，观察疫苗的分层情况并检测其146S含量变化，见表1。在4 ℃条件下，与ISA 201和Well佐剂相比，ISA 206佐剂制备的FMD灭活疫苗稳定性较好，保存60 d 146S的降解率为31%，而ISA 201为49%，Well为65%；在37 ℃条件下，Well佐剂在45 d就降解为0，而ISA 206和ISA 201都是60 d降解为0，见图3。

图3 3种疫苗在不同条件下的146S含量变化

表1 不同温度条件下3种疫苗的146S含量变化

3.3 动物免疫效果评价试验

将所制备的3种不同口蹄疫灭活疫苗免疫架子猪，用液相阻断ELISA方法检测动物血清中的抗体含量，并计算Log10（效价）对照值求平均数及标准差。抗体结果如表2所示。利用GraphPad Prism软件进行组间多重比较，P＜0.05表示差异显著，结果见图4。试验结果表明，ISA 206佐剂配制的FMD灭活疫苗的平均抗体水平高于其他两组，能显著提高动物血清中特异性抗体的水平。与筛选的新型佐剂相比，大规模用于兽用疫苗的ISA 206佐剂的稳定性和免疫效价较好。

图4 3种佐剂配制的疫苗150 d内血清平均抗体效价消长图

表2 3种佐剂配制的疫苗150 d内血清平均抗体效价消长情况

4 讨论及结论

新型双相乳剂呈多相分散体系，含有内部水滴的油滴分散成连续的水相，制备的疫苗可以同时提供抗原从外部水相的快速释放和从内部水相的延长释放，能快速、持续地刺激体液免疫应答[5]。本试验选择2种双相佐剂（Well佐剂和ISA 201佐剂）与现在使用的ISA 206佐剂，跟中农威特生物科技股份有限公司同批次的FMD O型抗原进行乳化制备疫苗，在对3种口蹄疫灭活疫苗的物理性状如剂型、粘度、粒径大小、离心效果及稳定性进行全面评价后，证明3种佐剂疫苗均达到了评判的质量标准。将制备的3种疫苗免疫动物，分别在14 d、21 d、28 d、60 d、90 d、120 d和150 d静脉采血，利用O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒检测血清中的抗体效价，结果显示这3组疫苗都随着免疫天数的增加，抗体水平也相应增加，在90 d时达到最大、120 d时呈下降趋势，其中ISA 206佐剂组抗体水平明显高于其他两组。以上结果表明，与ISA 201佐剂和Well佐剂相比，ISA 206佐剂在疫苗稳定性和免疫效果方面表现得更好，这为进一步筛选新型国产疫苗佐剂提供了数据支持。乳剂在兽用疫苗的制备中具有广阔的市场前景，乳剂类佐剂的基本组成成分在自然界中是比较容易获得的，并且价格较为低廉，作为递送类佐剂的代表，研究适合于口蹄疫灭活疫苗商业化生产的国产佐剂，是目前口蹄疫灭活疫苗生产厂家亟待解决的问题。