快速检测流行性乙型脑炎病毒IgG 抗体试纸条的制备

李春缘，梁克峰，任瑞文，陈迪佳，刘 炅，刘 军，陈 月，田 靖

（南部战区疾病预防控制中心，广东省虫媒病毒性传染疾病应急技术研究中心，广州 510507）

0 引言

流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）是由流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）感染导致，据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）估算，全球每年约有6.8 万临床病例。我国、东南亚和西太平洋地区为JE 主要流行区[1]，全球约一半的JE 病例发生在我国，除新疆、青海和西藏之外的多数省市均有分布[2]。JE 发病急，可表现出不同程度的意识障碍，严重病例可出现中枢性呼吸衰竭，致死率高达30%，存活的患者中30%～50%会留下永久性神经损伤或严重精神后遗症，目前尚无特效治疗方法[3]。媒介蚊虫作为JEV 扩增的中间宿主，是JEV 传播的重要途径，我国热区气候炎热潮湿，媒介蚊虫滋生迅速，JE 的威胁尤为严重[4]。

大部分JE 患者为非症状感染者，仅0.1%～1%的感染者表现为脑炎症状，给疾病诊断和监测带来困难[5]。作为JE 诊断的金标准，中和试验操作烦琐费时，仅用于实验室检测，在临床中应用较少。在临床诊断中，最常用的血凝抑制实验操作较为简单，但该方法灵敏性较低，特异性较差。因此，建立准确、快速的筛查和诊断方法，对于掌握JE 的真实流行病学数据以及制订疾病防控策略具有重要意义。胶体金法操作简便，对操作人员要求低，且人体感染JEV 后引起的免疫反应可以持续终生，其IgG 抗体的检测不受采样时间的限制，因此，该方法在流行病学调查及临床评估中具有重要的应用价值[6]。本研究基于前期筛选鉴定的JEV 特异性原核表达抗原[7]，利用免疫层析技术制备胶体金快检试纸条，并对技术参数进行系统优化与评估，为医疗条件较差的基层部队单位提供JE 快速筛查的新手段。

1 胶体金快检试纸条制备

1.1 实验菌株

JEV 高特异性原核表达抗原JEVAg45 由本实验室筛选和鉴定，由基因工程菌株pMAL-JEVAg45表达[7]。

1.2 试剂与耗材

胶体金溶液（粒径20 nm）购自珠海博美生物有限公司；金黄色葡萄球菌蛋白A（staphylococal protein A，SPA）和胶体金耗材套装[包括硝酸纤维素膜（NC 膜）、玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸、底衬板等]均购自上海杰一生物技术公司；人IgG 抗体购自上海羽朵生物科技有限公司；Amylose 树脂购自NEB公司。

1.3 重组蛋白纯化

将基因工程菌株pMAL-JEVAg45 接种于细菌基础培养基（luria broth，LB），当OD 值（光密度）为0.6 时，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl beta-D-thio-galactopyranoside，IPTG）诱导表达，之后收集菌体并经超声破碎后，采用NEB 公司的Amylose 树脂利用亲和层析法纯化重组蛋白，使用核酸蛋白分析仪测定其浓度，于-80 ℃保存备用。

1.4 胶体金标记SPA 制备

1.4.1 最佳pH 值确定

用0.1 mol/L 的碳酸钾溶液将胶体金溶液的pH值调整为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，各取100 μL 分别加入3 μg 的SPA，重复3 次，静置5 min 后加入20 μL 10%的NaCl 溶液，混匀，在室温下放置10 min，以溶液能保持红色的最低pH 值作为最佳pH 值。本研究中，当pH≥7.5 时胶体金溶液保持鲜艳红色，因此确定SPA 标记的最佳pH 值为7.5。

1.4.2 最适SPA 标记浓度确定

取最佳pH 值的胶体金溶液100 μL，分别加入3～7 μL 的SPA（1 mg/mL），每间隔0.5 μL 为1 个梯度，重复3 次，混匀后室温放置15 min，加入20 μL 10%的NaCl 溶液，室温放置2 h 后，记录仍保持红色的最小蛋白用量，在此基础上增加10%，确定为最适SPA 标记浓度。

1.4.3 金标SPA 制备

取30 mL 最佳pH 值胶体金溶液，在250 r/min搅拌下，逐滴加入最适标记浓度SPA 溶液1 mL，搅拌30 min 后逐滴加入10%的聚乙二醇20000（PEG 20000）溶液至最终浓度为0.25%，室温3 000 r/min离心15 min，弃沉淀，取红色上清液；红色上清液于4 ℃、11 000 r/min 离心35 min，取沉淀，用1%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）将沉淀混悬至原体积，重复离心2 次，以去除未结合的蛋白质；用含1%的BSA 和0.02 mol/L NaN3的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）重悬沉淀至原体积的1/10，即为金标记SPA，于4 ℃保存备用。最佳pH 值条件下，在SPA 为34.33～65.42 μg/mL 范围内，当SPA添加浓度至52.13 μg/mL 时，标记溶液仍可保持鲜艳红色，为保证标记反应的稳定性，最终确定胶体金标记的SPA 浓度为60.00 μg/mL。

1.5 固相NC 膜的制备

在NC 膜上，用不同浓度的JEVAg45 蛋白绘制检测线（T 线），用不同浓度的人IgG 抗体绘制质控线（C 线），间距为0.5 cm，自然晾干，切割成5 mm 宽的检测试纸条，置4～8 ℃干燥保存备用。包被抗原浓度实验表明，在过高的蛋白浓度条件下，试纸条的检测敏感性显著降低，过高的包被浓度导致较高的假阳性率，最终确定JEVAg45 抗原与人IgG 抗体NC膜最佳使用浓度分别为1.2 与0.9 mg/mL。

1.6 胶体金快检试纸条组装

将玻璃纤维素膜用金标记SPA 溶液浸泡，真空冷冻干燥后，制备金标垫；在底衬板中间固定NC膜，一端贴吸水纸，另一端贴样品垫，样品垫下贴金标垫，室温下加干燥剂后密封保存。胶体金快检试纸条成品如图1 所示。

图1 胶体金快检试纸条成品

2 胶体金试纸条评估

2.1 方法

2.1.1 实验毒株

JEV、黄热病毒（yellow fever virus，YFV）、西尼罗河病毒（West Nile virus，WNV）、登革热病毒1～4 型（Dengue virus type 1～4，DEV1-4）、基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）、辛德毕斯病毒（Sindbis virus，SINV）、盖塔病毒（Getah virus，GETV）、罗斯河病毒（Ross River virus，RRV）、鹭山病毒（Sagiyama virus，SAGV）、西门利克森林病毒（Semliki Forest virus，SFV）、玛雅罗病毒（Mayaro virus，MAYV）均由中国药品生物制品检定所引进，本研究室传代保存。

2.1.2 标本来源

12 例JE 患者血清标本于2007—2009 年期间收集于广州及周边地区；20 例登革热患者血清标本于2014 年7—11 月收集于广东省武警总队医院、解放军第458 医院（现南部战区空军医院）、解放军第421 医院（现陆军第74 集团军医院）；6 例基孔肯雅热患者血清标本于2010 年收集于广东省东莞市；1例黄热病患者血清标本收集于新疆地区。所有标本均经实验室反转录聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）法确诊。20 例阴性血清收集于健康体检人群，经实验室检测确诊为JEV 抗体阴性。

2.1.3 多克隆抗体（以下简称“多抗”）制备

将JEV 及13 种相近虫媒病毒C6/36 细胞培养物100 倍稀释，按200 μL/只分别接种于3 日龄昆明乳鼠，待其规律发病后将鼠脑研磨、离心、取上清，分别用0.01 mol/L PBS 进行10 倍稀释，按常规程序多点注射给免疫6～8 周龄昆明小鼠（300 μL/只），4 次免疫后在小鼠腹腔注射S180 细胞，3～5 d 后收集的腹水即为病毒多克隆抗体。利用免疫荧光法测定抗体效价后，于-80 ℃保存备用。

2.1.4 敏感性、特异性、稳定性及临床评估

用含2% BSA 的生理盐水将JEV 多抗按1∶10～1∶5 120 进行稀释，测定胶体金快检试纸条的敏感性及稳定性。将13 种相近虫媒病毒多抗按1∶20 稀释后作为参考样品，并设置阴性血清对照，鉴定试纸条的特异性。采用以上血清标本进行试纸条的临床评估。

2.2 结果

2.2.1 胶体金快检试纸条的敏感性及稳定性

敏感性实验表明，所制备试纸条在JEV 多抗1∶10～1∶640 稀释条件下均能清晰显示阳性结果（免疫荧光效价为1∶320），在1∶1 280 稀释时阳性条带不明显（如图2 所示），表明其具有较高的检测敏感性与较大的检测线性范围。稳定性实验表明，采用3 个不同批次试纸条的检测结果一致，表明该试纸条稳定性较好。

图2 胶体金快检试纸条敏感性实验结果

2.2.2 胶体金快检试纸条的特异性

特异性实验表明，所制备试纸条仅与JEV 多抗呈阳性反应，与黄热病毒、西尼罗河病毒、基孔肯雅病毒、登革热病毒1～4 型、辛德毕斯病毒、玛雅罗病毒、盖塔病毒、鹭山病毒、罗斯河病毒、西门利克森林病毒等其他13 种相近虫媒病毒多抗均无交叉反应，表明该试纸条具有良好的特异性（如图3 所示）。

图3 胶体金快检试纸条特异性实验结果

2.2.3 胶体金快检试纸条的临床评估

胶体金快检试纸条的临床样本评估结果表明，12 例JE 患者血清检测结果均为阳性，20 例登革热、1 例黄热病、6 例基孔肯雅热患者血清及20 例健康体检者血清均为阴性。采用免疫荧光法对上述样本进行检测，检测出阳性样本12 例，阴性样本47 例，制备的胶体金快检试纸条与免疫荧光法的评估结果符合率为100%，表明所研制的试纸条具备较高的敏感性与特异性（见表1）。

表1 符合性试验结果单位：例

3 讨论

近年来，研究人员对JEV 检测方法的研究多偏重于核酸检测，但JE 患者病毒血症持续时间短、病毒在脑脊液中的滴度较低以及病毒RNA 不稳定性等因素，给JEV 的核酸检测带来困难[8-9]。同时，核酸检测方法对设备和人力有较高要求，在基层卫生单位实施起来有一定难度。目前，基于血清学的检测方法仍是JE 临床诊断的主要方法，其中，微量中和试验是公认的血清学检测金标准，但操作复杂、耗时，而补体结合试验、血凝抑制试验等的特异性、敏感性较差，在临床中已较少使用[10]。酶联免疫吸附实验因具有特异性强、敏感性高等优势而被广泛采用。马淑娟等[11]评估了3 种猪JEV 商品化IgG 抗体酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒，结果表明其灵敏度介于41.94%～90.32%之间，特异度介于16.95%～79.66%之间，表明检测质量仍有待提高。

胶体金免疫层析技术操作简单、快速，对操作人员、设备要求较低，非常适合基层大批量样本的现场筛查[12]。田纯见等[13]以猪JEV 标准株作为抗原，提出JEV 抗体的胶体金免疫层析检测方法，经评估和猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、Ⅱ型圆环病毒病等无免疫学交叉反应。但在人群血清学检测方面，JEV 隶属黄病毒属，该类病毒之间的序列相似度较高，相互之间存在严重的血清学交叉反应，由于混合感染，患者体内存在交叉抗体，采用全病毒抗原难以避免与登革热等相近病毒的免疫学交叉反应[13-14]，对诊断抗原的特异性要求较高，现阶段市面上仍无成熟的用于人JE 诊断的胶体金快检试剂盒销售。为解决上述问题，本研究对JEV 抗原表位进行了较为系统的分析，在保证其免疫学反应亲和力的前提下，尽量缩短诊断用抗原长度，以减少非特异性反应。在此基础上，基于标准毒株、地方流行株及临床标本资源，对试纸条进行了详细评估，结果表明试纸条具有良好的敏感性和特异性，可清晰检测到按1∶640 稀释的JEV 抗体，与所试的10 余种相近虫媒病毒均无交叉反应，与历年来地方流行株抗血清均呈阳性反应。本研究临床评估阶段中制备的胶体金试纸条与免疫荧光法检测结果的符合率为100%。但收集的样品数量较少，考虑到临床中的大规模样品检测，故在接下来的实验中应增加临床JEV 阳性样本数，加强阳性质控，实现试纸条的标准化，为快检试剂盒的研制奠定基础，也为基层卫生单位快速筛查诊断JE 提供新的技术手段。